Способ очистки человеческого фибробластного интерферона Советский патент 1988 года по МПК C07K14/555 A61K38/21 

СлЭ

с ;о

О5 О5

Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - повышение производительности процесса. Подкисленный раствор интерферона пропускают через колонку с поперечно сшитым декстраном. Интерферон элюи- руют фосфатным буфером. Часть элюен- та пропускают через колонку с металл- хелатным носителем. Затем интерферон элюируют раствором гистидина с хлористым натрием. Полученный элюент содержит незначительное количество пирогенных веществ, соответствующее требованиям для биологических веществ. 2 табл.

см

Изобретение относится к медицине и касается способа очистки чело.ве- ческого фибробластного интерферона.

Целью изобретения является повышение степени очистки человеческого фибробластного интерферона, которая достигается за счет хроматографии на поперечно сшитом декстране, содержащей сульфонильные группы, и на производных агарозы, включающих карбоксиметиламиногруппу и ион , или Ni, или , или Си.

Способ осуществляют следующим образом.

Раствор человеческого фибробластного интерферона с рН 1-3 пропускают через колонку с SP-сефадексом, лонку промывают водой, элюцию интерферона осуществляют при рН 7,0-11,0 и затем через колонку с эпоксиактиви рованной сефарозой-бВ, содержащей бискарбоксиметиламиногруппу, а в качестве иона металла Са, или Ni, или Zn, или , элюцию интерферона осуществляют раствором гистядина.

Пример 1. Интерферонсодер- жацую жидкость готовят обработкой человеческих фибробластных клеток (обычная диплоидная культура) по- средством Поли-И: Поли-С в среде Игла-Мем с последующей, обработкой циклогексимидом и актиномицином Д (супериндукция).

Раствор интерферона (рН 7,4), имеющий активность интерферона 3200 МЕ/ил и концентрацию белка 20 мкг/мл, доводят до рН 2,0 соляной кислотой и пропускают через колонку с поперечно сшитым декстраном, содержащим сульфонильную группу, SP - сефадексом (200 мл, 4,6 см х 12 см). После пропускания 60 л раствора, содержащего интерферон (с общей активностью 1,9 X ), колонку промывают 2 л воды. Элюат содержал 9,5 X ю нЕ (5%) активности интерферона. Колонку затем промывают 0,1 М Na-фосфатным буфером при рН 8,3, причем интерферон выходил в первых 2,28 л элюента. Эта фракция содержала 1,8 X 10® № (94%) активности интерферона и 23 мг белка. Удельная активность бьша 8 х 10 МЕ/мг. белка. Концентрация составляла 26 раз и степень очистк 50 раз.

Носитель для металл-хелатной хроматографии приготавливают по

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

методу Пората. Имидоуксусную кислоту (14г) и карбонат натрия (20г) растворяют в воде (100 мл) и подвергают воздействию эпокси-активированную сефарозу - 6В (135 мл, влажный объем) в течение 16 ч при 56°С. После фильтрации и промывания носитель обрабатывают 1 М этанол-амином (100 мл) в течение 4 ч при 56°С, фильтруют, промывают и хранят при 4 С.

Колонку для Zn - хелатной хроматографии (45 мл, 3 см X 6,4 см) приготавливают пропусканием 1%-ного раствора хлорида цинка через носитель в колонке. Через эту колонку пропускают 2,28 л элюента с колонки с SP-сефадексом и 800 мл физиологического раствора. Раствор, который проходил через колонку, и промывной раствор содержали 8 х 10 ME (4%) активности интерферона. Колонку затем промывают 0,1 М раствором ; Na-фосфатного буфера (рН 4,5), содержащим физиологический раствор (1:9, объем на объем). Первая фракция (262 мл) содержала 1,4 х (72%) активности интерферона. Концентрация интерферона в этой фрак- 1ДИИ была 5,3 X 10 Ж/шт и концентрация белка - 2 мкг/мл с удельной активностью 2,7 х 10 МЕ/мг белка, что указывает на очистку в 1700 раз и концентрацию в 166 раз по сравнению с исходным раствором.

Исходный раствор интерферона, содержащий пирогенные вещества, давал положительную реакцию при проверке по Лимулюс-тесту. Часть пироген- ных веществ после прохождения через SP-сефадекс без снижения активности интерферона снова давала положительную реакцию при проверке по Лимулюс- тесту. Оставшиеся пирогенные вещества не задерживались на -хелатной колонке и удалялись в процессе пропускания через колонку и промывания. Элюент с металл-хелатной колонки содержал незначительные количества пирогенных веществ.

Часть конечной фракции элюента после фильтрации через 0,2 ммк фильтр вводили внутривенно трем кроликам (1,5. X 10 МЕ/кг веса тела). Сумма повышения температуры составляла О,63°С.

Пример2. В качестве исходного раствора интерферона используют

интерферон, подобный по примеру 1. Подкисленный раствор интерферона (48 л, содержащих 5000 МЕ/мп, общая активность 2,4 х 10 ME) с содержан ем белка 25 мкг/мл пропускают через колонку с 200 мл SP-сефадекса и колонку промывают 2 л воды. Интерферо элюируют 2,0 л фосфатного буфера рН 8,3. Получили 2 X 10 IiE(83%) ..активности и 100 иг (10,4%) белка (концентрация в 20 раз и очистка в 10 раз). Часть элюента из колонки с SP-сефадексом (200 мл с активностью 2 X 10, содержанием общего белка 10 мг) пропускают со скоростью 8 мл/ч через колонку с 2 мл хелатного носителя. После промывани 20 МП воды и 20 мл физиологического раствора интерферон злюируют 0,2 М раствора гистидина, содержащим 0,2 М хлористого натрия рН 7,5. Элю ент 6,0 мл) содержал 2,3 х 10 11Е/м интерферона (общая активность, X 10 №/69%) и 15 мкг/мл белка (общее количество белка 0,09 мг, выход 0,9%. Удельная активность это фракции составила 1,5-х 10 НЕ/мг белка, концентрация составила 460 раз, очистка - 750 раз по сравнению с исходным раствором интерферона.

П- р и М е р 3. Способ осуществляется согласно примеру 2 за исключением того, что используют Ni -xe- латную колонку вместо Со -хелатный колонки.

Элюент (6,0 мл) содержал 2,3 мл X IO fIE/мл (выход 69%) и 50 мкг/мл белка (выход 3%). Удельная активность составляла 5 х 10 IiE/мл белка.

Пример Д. Способ осуществлется согласно примеру 2 за исключением того, что Zn -хелатная колонка используется вместо Со -хелат- ной колонки.

Элюент (6,0 мл) содержал 2,3 х X 1 о ME/МП (выход 69%) и 30 мкг/мл белка (выход 1,8%). Удельная активность 8 X 10 МЕ/мг белка.

Пример 5. Способ осуществляют согласно примеру 2 за исключением того, что Cu -хелатная колонка используется вместо Со -хе- латной колонки.

Элюент (6,0 мл) содержал 1,8 х х 10 Г-ТЕ/мл (выход 54%) и 150 мкг/мл белка (выход 9%). Удельная активность 1,2 X Ю МЕ/мг.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Пример 6. Элюцию интерферона с колонки с SP-сефадексом проводят при рН 11,0.

Исходный интерферон Б среде Игла-Мем с общей активностью 3,2 X , общим белком 89 мг, удельной активностью 3,6 х 10 МЕ/мг доводят до рН 2,0 добавлением 6 N НС1, затем смешивают с 3,0 г SP-сефадекса G-25 (Pharmacia) и перемешивают в течение ночи при . После отстаивания в течение 3 ч су- пернатант удаляют и SP-сефадекс про- Mbffiaitft 3 раза 50 мл дистиллированной воды. Суспензию SP-сефадекс (объем в набухшем состоянии около 20 мп) в 40 МП дистиллированной воды разделяют между 20 пластйковьми пробирками. В каждую из этих пробирок прибавляют по 10 МП 0,1 М фосфата натрия (одноосновного, двухосновного или трехосновного),доводя рН соответственно до 3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12.

Пробирки, содержащие SP-сефадекс и фосфатньй буфер для перемешивания тщательно, встряхивают в течение 1 ч И супернатант из каждрй пробирки пропускают через фильтр 0,2 ммк. После этого определяют активность интерферона в 10/ фильтратах (см. табл. 1).

Интерферон элюируется при рН 7,0- 11,0.

Пример 7. Интерферон в О,1 М растворе фосфата натрия (рН 7,6). 16 мл с общей активностью 8 х 10 ME, общим белком 8 мг, удельной активностью 10 X 10 ИЕ/мг белка, элюиро- ванный с SP-сефадекса, пропускают через колонку с Zn -хелатной ага- розой в количестве 2 мп и колонку промывают О,1 М раствором фосфата натрия и дистиллированной водой. После этого Zn -хелатную агарозу разделяют на 4 порции и помещают в 4 пластиковые пробирки. В каждую пробирку прибавляют 5 мл забуферен- ного 0,2 М раствора ацетата натрия, содержащего хлорид натрия в кон- центрации 1 М и имеющего рН соответственно 1,5; 3,0; 4,5; 6,0, тщательно перемешивают в течение нескольких минут и определяют активность интерферона в каждой пробирке (см. табл.2).

Интерферон элюируется при рН 3,0- 5,5.

513896676

По известному способу объем , предварительно проводят хроматохелатного носителя применяется дляграфию на поперечно сшитом декстраочистки 14 объемов интерферона, ане, содержащем сульфонильную группу

в предлагаемом способе 1 объем но- при рН элюции 7,0-11,0, а хелатную

сителя применяется для очисткихроматографию осуществляют с ис1000-6000 объемов интерферона.пользованием производного агарозы,

содержащей бискарбоксиметиламиноФормула изобретениягруппу, а в качестве иона металла

10 ион Со , или Ni, или Zn

иСпособ очистки человеческого фиб- Си, причем элюдию проводят раст- робластного интерферона, путем ме- вором гистидина в случае Со, талл-хелатной хроматографии, о т л и- Ni, Zn, или кислым рас- чающийся тем, что, с целью твором с рН 3,0 - 5,5 в случае повышения производительности процес- 5 Zn -xeлaтнoй хроматографии.

Т а б л и ц а 1

10 ион Со , или Ni, или Zn

иили

Таблица 2