Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к молекулярной вирусол.огии, и может быть использовано для типирования вирусов гриппа.
Целью изобретения является увеличение чувствительности способа типирования реассортантов вируса гриппа.
Увеличение чувствительности достигается тем, что на фильтрах иммобилизуют вирусный лизат, в гибридизацион- ную систему вносят дополнительно конкурирующую РНК из эталонных штаммов, Уестирование результатов проводят с помощью денситометрирования, и типи- рование проводят на основе сравнения полученных данных со значениями для внутренних стандартов.
Пример 1. Определение родительской принадлежности гена нуклео- протеина NP у лабораторных реассортантов.
Изучают две группы лабораторных реассортантов с их родителями: родительские вирусы А/Ленинград/9/ 6 (HON1) и А/СССР/2/85 (H3N2) и их ре- ассортанты N8 18, If 24, V 25, К 32; родительские вирусы А/Ленинград/13 / 17/57 (H2N2) и А/Новошахтинск/3/86 (H1N1) и их реассортант № 3; а также 5 эталонных штаммов: А/РК/З/З (HON1), А/Хабаровск/7А/77 (НШ), А/Сингапур/1/57 (H2N2), А/Гонконг/ /1/68 (H3N2) и А/Киев/59/79/К(н1Н1), на основе которого получают молекулярные зонды.
Вирусы накапливают в аллантоиспой полости 10-дневных куриных эмбрионов. 4,5 мл аллантоисной жидкости с вирио- нами осветляют центрифугированием в течение 30 мин при 10000 об/мин (12000 g), после чего вирус осаждают на дно центрифугированием в том же
3
IB
СП
4ъ
О
Јь 00 &
315Ш86
роторе 30 мин при 0000 об/мин (200000 g) . Жидкость сливают и к вирусной бляшке приливают k$ мкл буфера: kO мМ трис-HCl, рН 7,3, содержа- щего 250 мкг/мл протеиназы К. Суспензию помещают в термостат при 37 С, время от времени пипетируя. Через 2 ч добавляют равный объем 0,5%-ного раствора додецилсульфата лития и ос- JQ тавляют при 37°С. Через 30 мин пробирки с лизированными вирионами помещают в ледяную баню. По шаблону на 96 ячеек из каждой пробирки наносят
тировавших трифосфатов освобождаютс гель-фильтрацией.
Предгибридизацию мембран в тече ние 1-3 ч ведут в 2 мл буфера для гибридизации состава: 50%-ный форм амид, 6 х SSC, по 0,02% бычьего сы роточного альбумина, фиколла и пол в 1нилпирролидона.
кРНК для конкурентной точечной гибридизации выделяют из куриных э брионов, зараженных эталонными шта мами, стандартными фенольно-детер- гентным методом. На один фильтр не
в 2 точки по 2 мкл лизата на 8 пред- ходимо около 100 мкг конкурирующей
обработанных фильтра. Предобработан- ные фильтры получают следующим образом: из нитроцеллюлозных фильтров вырезают прямоугольники размером
РНК, которую осаждают центрифугиро нием из-под спиртового раствора в чение 10 мин при 3000 g и высушив в вакууме к моменту получения 33Ртировавших трифосфатов освобождаются гель-фильтрацией.
Предгибридизацию мембран в течение 1-3 ч ведут в 2 мл буфера для гибридизации состава: 50%-ный форм- амид, 6 х SSC, по 0,02% бычьего сывороточного альбумина, фиколла и поли- в 1нилпирролидона.
кРНК для конкурентной точечной гибридизации выделяют из куриных эмбрионов, зараженных эталонными штаммами, стандартными фенольно-детер- гентным методом. На один фильтр необходимо около 100 мкг конкурирующей
РНК, которую осаждают центрифугированием из-под спиртового раствора в течение 10 мин при 3000 g и высушивают в вакууме к моменту получения 33Рме
Изобретение относится к молекулярной вирусологии и может быть использовано для типирования вирусов гриппа. Целью изобретения является увеличение чувствительности способа типирования реассортантов вируса гриппа. Увеличение чувствительности достигается тем, что на фильтрах иммобилизуют вирусный лизат, в гибридизационную систему вносят дополнительную конкурирующую РНК из эталонных штаммов, тестирование результатов проводят с помощью денситометрирования, а типирование проводят на основе сравнения полученных данных со значениями для внутренних стандартов. 2 табл.
77 х 117 мм, смачивают дистиллирован- JQ ченого молекулярного зонда. К трем
ной водой, которую затем замещают 20 х SSC, после чего фильтры высушивают на воздухе. Для удобства на всех фильтрах схема нанесения препаратов идентична. Две ячейки используют для определения уровня фона и на них вРНК не наносят.
Для иммобилизации вРНК лизирован- ных вирионоа после нанесения всех пре- препаратов фильтры отжигают 2 ч при 30 80°С в вакууме, затем промывают в воде от солей, придающих фильтрам высокую хрупность, и высушивают на воз- ДУхе.
В качестве молекулярного зонда ис- ,t пользуют ДНК плазмиды pBRl-NP/2, несущей полноразмерную ДНК - копию гена нуклеопротеина (NP) рекомбинантного штамма А/Киев/59/79/Р (НШ), происходящего от эпидемического вируса 4Q А/Киев/59/79/Н1N1), npk обретенного последним в результате реассортации с природными эпидемическими вирусами сероподтипа H3N2. Штамм Е. coli HB1Q1, содержащий указанную плазмиду, 4$ выращивают в 0,5 л 1%-ной среды ВН1 до поздней логарифмической фазы, бактериальные клетки собирают центрифугированием при 3000 g в течение 10 мин, плазмидную ДНК выделяют ще- почным методом с дополнительной очисткой равновесным центрифугированием в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием при 200000 g и 20°С
пробиркам, содержащим по 100 мкг вы сушенных осадков вРНК одного из эта лонных штаммов: А/Хабаровск/7 /77 (НШ), А/Сингапур/1/57(H2N2) или 2-, А/РК/б/З (HON1), добавляют по 80 мк
50
формамида и по 20 мкл водного раст ра г Р-ДНК плазмиды pBPJ-NP/2. Про бирки прогревают на кипящей водяной бане в течение 1,5 мин, добавляют по 2 мл гибридизационного буфера, полученный раствор вливают в полиэ леновые мешочки с фильтрами в гибри дизационном буфере и помещают в те мостат на 2°С. Через 16-20 ч мемб ны дважды отмывают раствором 2 х S при комнатной температуре и дважды промывочным раствором (0,1% SDS; 0,1 х SSC) при 55-60°С. После высу шивания проводят авторадиографию с рентгеновской пленкой. Каждую проя ленную пленку дважды сканируют при 50 нм на денситометре, представля щем значения оптической плотности для каждой точки.
Для обсчета полученных данных п водят усреднения и вычитают фон ра диоавтографа. Тогда средняя оптиче кая плотность A(yNP)H) , пропорцио нальная количеству прогибридизован го зонда NP с РНК вируса при наличи в гибрИдизационном буфере конкуриру ющей кРНК одного из эталонных виру сов Н равна:
АИ,мр,и)
1
5
(А;
Y HP, H)
в течение 36 ч. Для работы отбирают нижнюю полосу из градиента с кольцевой ковалентно замкнутой плазмидной ДНК, которую метят WP в стандартной реакции ник-трансляции. От непрореаQ ченого молекулярного зонда. К трем
0
t Q $
пробиркам, содержащим по 100 мкг высушенных осадков вРНК одного из эталонных штаммов: А/Хабаровск/7 /77 (НШ), А/Сингапур/1/57(H2N2) или -, А/РК/б/З (HON1), добавляют по 80 мкл
50
формамида и по 20 мкл водного раствора г Р-ДНК плазмиды pBPJ-NP/2. Пробирки прогревают на кипящей водяной бане в течение 1,5 мин, добавляют по 2 мл гибридизационного буфера, полученный раствор вливают в полиэтиленовые мешочки с фильтрами в гибри- дизационном буфере и помещают в термостат на 2°С. Через 16-20 ч мембраны дважды отмывают раствором 2 х SSC при комнатной температуре и дважды промывочным раствором (0,1% SDS; 0,1 х SSC) при 55-60°С. После высушивания проводят авторадиографию с рентгеновской пленкой. Каждую проявленную пленку дважды сканируют при 50 нм на денситометре, представляющем значения оптической плотности для каждой точки.
Для обсчета полученных данных проводят усреднения и вычитают фон радиоавтографа. Тогда средняя оптическая плотность A(yNP)H) , пропорциональная количеству прогибридизованно- го зонда NP с РНК вируса при наличии в гибрИдизационном буфере конкурирующей кРНК одного из эталонных вирусов Н равна:
АИ,мр,и)
1
5
(А;
Y HP, H)
i i , .. А/
ЧО , NP.M) ,«
- А1,
(о1, нг,и)
+ А
(Y1,NP,H)
. Z. . 1
А(01, NP,H) А(У, NP,M)
- АД
П,НР, и)
де А , А2 - значения оптической плотности соответственно при первом и втором сканировании данного радиоавто- , графа;
Yf, Y2 - индексы,соответственно первого и второго нанесений лизата вируса,
NP - индекс гибридизации с JQ плазмидой, несущей ген;
NH - индекс гибридизации с введением конкурирующей кРНК одного из четырех эталонных штаммов, при-15 нимает следующие значения: 0 - при внесении кРНК вируса А/РИ/8/3 4 (HON1); 1 - при внесении кРНК вируса А/Хабаровск/ 20 ,
/7V77 (H1N1); 2 - при внесении кРНК вируса А/Сингапур/1/57 (H2N2) ,v 3 - при внесении кРНК вируса А/Гонконг/1/68 (H3N2); О1, О2 - индексы соответственно
25
НОДЭГ,
. iV.x.
одэг(х
ИР, о)
100
(Y.MP) ОДЭГКмр 1} +
100„
одэг ( Y, )+ олэг(ч N Р( о)
.100
,.-. : бдэг(,ГГ+
. ОвЭГ&йЬЛ-Х.
одэг(ХМР,„ +
Сравнивают полученные значения НОДЭГ анализируемых штаммов со значениями НОДЭГ эталонных или родительских штаммов и относят изучаемый вирус к той или иной группе методом наименьших квадратов (см. табл. 1, 2).
Формула изобретения Способ генотипирования реассортан- тов вируса гриппа, включающий накопление и концентрирование вируса, иммобилизацию РНК-содержащего материала на фильтрах, точечную гибридизацию с ДНК-зондами, авторадиотрафию и анаA x 3 LH ljА СКАН М
ОДЭГ
(Л NP 2.)
одэги
мг, о)
40
45
50
лиз полученных результа чающийся тем, ч увеличения чувствительн на фильтрах иммобилизую зат в гибридизационную жащую плазмиду pBR1-NP/ полнительную конкурирую эталонных штаммов, тест зультатов проводят с по метрии, на основании по чений оптической плотно параметры нормированной денситометрической эффе ридизации НОДЭГ по форм
х 100
НОДЭГ
У,3
}jA.Ji 2.. A (K,s. HI) A(V,S,
+ 6il«Ai i A jA-iJfi.
(K.S.H)(K S|Klj
x 100
JJASuU J.. + §i-bsZl4jr 4 Il :
A K.S.H)
U,s, нМ
AIX.S.H4J
Q
5 0 ,
первой и второй точек
без РНК.
Условия гибридизации с равными фильтрами различны, поскольку зонд реагирует с различными кРИК с разной эффективностью в зависимости от отличий в их нуклеотидных последовательностях. Поскольку РНК NP гена эталонного вируса А/Киев/59/79/R имеет 100% гомологию с клонированной последовательность МР гена молекулярного зонда, за точку отсчета принимают уровни гибридизации для указанного вируса. Для каждого вируса определяют величину относительной денсито- метрической эффективности гибридизации (ОДЭГ):
JliAfUU. x
Д.
°ЛЭГ(,,мР,
5
100%,
(K.NP.H)
где К - индекс для вируса А/Киев/59/79й,
Для определения принадлежности NP генов анализируемых штаммов для анализируемых штаммов, а также для эталонных штаммов вычисляют нормированные отношения денситометрических эф- фективностей гибридизации (НОДЭГ):
одэг(х
ИР, о)
ОДЭГ
(Л NP 2.)
одэги
мг, о)
лиз полученных результатов, отличающийся тем, что, с целью увеличения чувствительности способаf на фильтрах иммобилизуют вирусный ли- зат в гибридизационную систему, содержащую плазмиду pBR1-NP/2, вносят дополнительную конкурирующую РНК из эталонных штаммов, тестирование результатов проводят с помощью денси.о- метрии, на основании полученных значений оптической плотности опререл«- от параметры нормированной относительной денситометрической эффективности гибридизации НОДЭГ по формулам
х 100
+ 6il«Ai i A jA-iJfi.
(K.S.H)(K S|Klj
x 100
§i-bsZl4jr
AIX.S.H4J
ttA.u2L. x i A(K.S.HM
00
Д
JJJJuiXUlI К5Х5HII ЗЛИ K.S,H )A(K,S. н) AUS.H)
А - среднее значение оптической
плотности;
S - индекс использования в гибридизации молекулярного зонда 10 с ДНК-копией сегмента S; Y - индекс анализируемого вируса, К - индекс1 вируса, сегмент которого имеет максимальную среди анализируемых вирусов гомоло- 15
Т а б л и ц а 1
Определение родительской принадлежности гена нуклеопротеина NP
у лабораторных реассортантов
Таблица2
Определение родительской принадлежности генов у лабораторных реассортантов с помощью конкурентной гибридизации
Вирус
00
Н
гию с использованным в реакции зондом{
- индекс гибридизации с введением конкурирующей РНК одного из эталонных штаммов, и с помощью метода наименьших квадратов производят отнесение тестируемого штамма к соответствующему эталонному сероподтипу.
Ген
А/Ленинград/ 13V1 7/57(H2N2) Лд Лл Лд Лд Лд Лд Лд Лд А/Новошахтинск/3/86(Н1Ы1) И Н ПНИ Н Н И № 3Лд Лд Лд Н Лд Н Лд Лд
С - принадлежность сегмента штамму A/CCCP/2/85(H3N2); Л - принадлежность сегмента штамму А/Ленинград/9/ 6 (HON1); Лд - принадлежность сегмента штамму А/Ленин- град/13 /17/57 (H2N2)j Н - принадлежность сегмента штамму А/Новошахтинск/3/86 (H1N1).
Редактор Т.Лаэоренко
Составитель А.Спундэ Техред А.Кравчук
Заказ 56
Тираж ЬЭ1
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. Ц/$
- ---------------------------------------------- ---- -.
Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул.Гагарина, 101
Корректор.О.Ципле
Подписное
| Pljusnin A.Z | |||
| et al | |||
| Virol, 1987, 38, N 2, 111-m. |
