ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/47/ПАНАМА/99/234(Н3N2) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ДЕТЕЙ Российский патент 2005 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма А/47/Панама/99/234 (H3N2). Известный вакцинный штамм вируса гриппа А/47/Сидней/97/14 (H3N2) - прототип [1] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, аналогичным вирусу А/Панама/2007/99 (H3N2).),

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса А/Панама/2007/99 (H3N2).

Вакцинный штамм А/47/Панама/99/234 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Панама/2007/99 (H3N2) с холодоадаптированным штаммом А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) - донором аттенуации - с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к вирусу А/Ленинград/134/47/57 (H2N2). Донор аттенуации - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа А/Ленинград/134/47/57 (H2N2), разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для детей [2].

Вакцинный штамм является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 40°С составляет 6,1 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 25°С - 3,0 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл).

Один из двух поверхностных белков вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА идентичен вирусу А/Панама/2007/99 (H3N2), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Методом рестрикционного анализа ДНК копий генов [3] установлено, что вакцинный штамм А/47/Панама/99/234 (H3N2) унаследовал все шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, РА, NP, М, NS), от донора аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2), а второй из двух генов, кодирующих поверхностные белки - нейраминидазу (NA), - от эпидемического вируса А/Панама/2007/99(H3N2). Рестрикционный метод основан на амплификации участков РНК длиной около 150-300 нуклеотидов, включающих уникальные нуклеотидные последовательности, характерные только для донора аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2), но не для современных эпидемических вирусов гриппа. Обработка амплифицированных фрагментов ДНК специфическими эндонуклеазами (рестриктазами) с последующим электрофорезом обработанных рестриктазами фрагментов ДНК в 1,7%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиума бромида, позволяет четко дифференцировать принадлежность генов исследуемых реассортантных штаммов к эпидемическому вирусу или донору аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2).

На чертеже в качестве примера представлена рестрикция ДНК-копии фрагмента гена РА эндонуклеазой Asn I. 1-я дорожка - ДНК маркер молекулярного веса IX; 2-я дорожка - эпидемический вирус А/Панама/2007/99 (H3N2); 3-я и 5-я дорожки - кандидат в вакцинные штаммы А/47/Панама/99/234 (H3N2); 4 и 6-я дорожки - донор аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2). В РА гене донора аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) в позиции нуклеотида 107 имеется замена Т→С по сравнению с современными эпидемическими штаммами, приведшая к аминокислотной замене лейцина эпидемических вирусов на пролин у донора аттенуации. Донор аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) имеет на этом участке сайт рестрикции для экзогенной рестриктазы Asn I. У эпидемических вирусов этот рестрикционный сайт отсутствует. Т.о., обработка всех исследуемых фрагментов ДНК данным ферментом приводит к разрезанию участка гена РА на два более мелких фрагмента, если он происходит от донора аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2). В случае РА гена эпидемического вируса расщепления не происходит.

Результаты рестрикционного анализа всех генов вакцинного штамма А/47/Панама/99/234 (H3N2) представлены в табл.1.

Таким образом, представленный вакцинный штамм А/47/Панама/99/234 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью поверхностных белков эпидемического вируса А/Панама/2007/99 (H3N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34°С в течение 48 часов - 8,0 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность -1:512.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Пример получения вакцинного штамма А/47/Панама/99/234 (H3N2) представлен в прилагаемом паспорте.

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма - А/47/Панама/99/234 (H3N2)

2. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:

а) эпидемический вирус - А/Панама/2007/99 (H3N2)

б) донор аттенуации - А/Ленинград/134/47/57 (H2N2)

3. Количество пассажей - 6 в процессе рекомбинации

4. Характеристика штамма до лиофилизации:

а) оптимальные условия репродукции - 33°С, 48 часов

б) гемагглютинирующая активность -1:512

в) инфекционная активность - 8.0 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл

г) чувствительность к ингибиторам - ингибиторорезистентный

д) разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 40°С - 6.1 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл

е) разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 25°С - 3.0 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл

ж) структура генома реассортанта:

- гены от эпидемического вируса - НА, NA

- гены от донора аттенуации - РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS

5. Характеристика штамма после лиофилизации:

а) дата лиофилизации - 24 января 2002 года

б) объем материала в ампуле -1 мл

6. Антигенная специфичность

а) гемагглютинина в РТГА - идентичен вирусу А/Панама/2007/99 (H3N2), хорьковой антисывороткой к которому полностью нейтрализуется

б) нейраминидазы - идентична вирусу А/Панама/2007/99 (H3N2) по данным ПЦР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов.

7. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении - безвреден.

ШТАММ А/47/ПАНАМА/99/234 (H3N2) АРЕАКТОГЕНЕН ПРИ ИНТРАНАЗАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ ДЕТЯМ 3-14 ЛЕТ.

Пример. Группу из 64 детей в возрасте 3-14 лет, вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл рекомбинантным вакцинным штаммом А/47/Панама/99/234 (H3N2) с инфекционной активностью 8,0 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 47 человек получила плацебо. В группе вакцинированных сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С, средних реакций с повышением температуры в диапазоне 37,6-38,5°С и слабых температурных реакций до 37,5°С не наблюдалось.

В контрольной группе детей, получивших плацебо, сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С, средних реакций с повышением температуры в диапазоне 37,6-38,5°С и слабых температурных реакций до 37,5°С не наблюдалось (таблица 2).

Таким образом, вакцинный штамм А/47/Панама/99/234 (H3N2) по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФС 42-3353-97 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения детям 3-14 лет.

ЛИТЕРАТУРА

1. Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. и др. Штамм вируса гриппа А/47/Сидней/97/14 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для детей. Патент РФ №2159809 от 27.11.00. Опубл. БИ 2000. - №33.

2. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.

3. Klimov A.I., Сох N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines // J. Virol. Methods, - 1995a. - Vol.52. - №1-2. - P.41-49.

Изобретение относится к области биотехнологии. Вакцинный штамм А/47/Панама/99/234 (H3N2) - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса А/Панама/2007/99/ (H3N2) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для детей. Штамм А/47/Панама/99/234 (H3N2) активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 33-34°С, характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал от эпидемического вируса два гена, кодирующих поверхностные белки (гемагглютинин и нейраминидазу) и шесть генов, кодирующих негликозилированные белки от донора аттенуации. Штамм А/47/Панама/99/234 (H3N2) ареактогенен для детей при интраназальном введении. Вакцинный штамм А/47/Панама/99/234 (H3N2) по биологическим свойствам и показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФС 42-3353-97 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения для детей 3-14 лет. 2 табл., 1 ил.

Штамм вируса гриппа А/47/Панама/99/234 (H3N2) ГИСК №141 (Государственный институт стандартизации и контроля им. Л.А.Тарасевича), используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для детей.