Питательная среда для выращивания фрезий IN VIтRо Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и касается новых составов питательных сред для выращивания растений способом тканевых культур или из меристем.

Цель изобретения - увеличение выхода и улучшение роста побегов.

В известную питательную среду для выращивания растений in vitro, содержащую натрий фосфорнокислый, аммоний азотнокислый, кальций хлористый, калий азотнокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый, железо сернокислое, натрий ЭДТА, цинк сернокислый, борную кислоту, марганец сернокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, натрий молибденовокислый, калий йодистый, тиамин, пиридоксин, витамин РР, глицин, аденин, гидролизат казеина, мезоинозит, ауксин, ци- токинин, гибберелловую кислоту, сахарозу и агар вместо мезоинозита вводится смесь органических кислот цинка трикарбоновьтх кислот таких, как: лимонная кислота, яблочная кислота или их соли, при этом дополнительно может быть добавлена итаконовая и (или) oi-кетоглутаровая кислота или ее соли, причем компоненты берут в массовых соотношениях 1:1:1 или 1:1:1:1:1. Питательная среда содержит макроэлементы, микроэлементы и биологически активные вещества в следующих отношениях, мг/л:

ел

СЛ

оо №

00 Јь

Натрий фосфорнокислый двузаме- щенный

169-172

Аммоний азотнокислый

Кальций хлористый Натрий ЭДТА Калий азотнокислый

Магний сернокислый

Калий фосфорнокислый однозамещен- ный

Железо сернокислое

Цинк сернокислый Борная кислота Марганец сернокислый

Медь сернокислая Кобальт хлористый Натрий молибдено- вокислый Калий йодистый Тиамин Пиридоксин Витамин РР Лимонная кислота Изо-лимонная кислота

Яблочная кислота Глицин. Аденин

Гидролизат казеина Ауксин Цитокинины Гибберелловая кислота Сахароза Агар Вода

Заменитель мезоинозита - смесь ганических кислот (лимонная кисло, изо-лимонная кислота, яблочная слота) или их соли может быть принены в любых модификациях, при ом можно добавлять дополнительно аконовую и (или) оЈ-кетоглутаровую слоту для интенсификации процессов кла Кребса и ПАВ для лучшего досжения однородности питательной еды.

Добавление лимонной, изо-лимонной яблочной кислот интенсифицирует оцессы дахания или так называемый кл Кребса, ускоряя процессы роста развития клеточных культур или ристем. Дополнительно добавленная аконовая и (или) о -кетоглутаровая слота могут в определенных услови1640-1660

435-445 37,2-37,4

1850-1910 365-375

160-171

27,5-28,0 8,5-8,7 6,0-6,4 ,

22-22,5 0,024-0,025 0,024-0,025

0,24-0,26 0,8-0,85 0,3-0,5 0,4-0,6 0,4-0,6 20-70

20-70

20-70 1,5-2,5

79-81 980-1020

1-3 0,1-1,0

0,05-0,15 20000-35000 8000-ПООО Остальное

5

0

ях ускорять процессы роста и развития, но их присутствие не является обязательным. Лимонная кислота действует также как комплексен, т.е. исключает возможность выпадания осадком тяжелых металлов, вместе с тем все предлагаемые органические кислоты могут быть совместимы с поверх- Q ностно-активными веществами или другими комплексонами.

Пример 1. Питательную среду для выращивания фрезий готовят растворением в бидистиллированной воде компонентов, мг/л: Натрий фосфорнокислый двузамещенный170,0 Аммоний азотнокислый 1650,0 Кальций хлористый 440,0 Калий азотнокислый1900,О Магний сернокислый 370,0 Калий фосфорнокислый одно замещенный170,0 Железо сернокислое 27,8 5 Натриевая соль эти- лендиаминтетрауксус- ной кислоты 37,3 Цинк сернокислый 8,6 Борная кислота 6,2 Марганец сернокислый 22,3 Медь сернокислая 0,025 Кобальт хлористый 0,025 Натрий молибденово- кислый 0,25 Калий йодистый 0,83 Тиамин 0,4 . Пиридоксин 0,5 Витамин РР 0,5 Натриевая соль лимонной кислоты . 66,6 Натриевая соль изо- лимонной кислоты 66,6 Натриева-я соль яблочной кислоты - 66,6 Глицин , 2,0 Аденин 80,0 Гидролизат казеина 1000,0. /3-Ин до лилукс усна я кислота9 2,0 0 Кинетин 0,2 Гибберелловая кислота 0,1 Сахароза 30000,0 Агар 10000,0 5 Отдельно готовят среду с мезоино- зитом и среду без мезоинозита и органических кислот. После определения рН среду разливают в пробирки по

0

5

0

5

515

1 0 мл и в течение 20 мин стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении пара 0,8-1,0 атм. В стерильном боксе в каждую пробирку помещают одну меристему, а штатив с пробирка- ми помещают в климатическую камеру, где из меристем развиваются растения, образующие стебли. Стебельки отделяют от маточного растения и вторично сажают на среду, где образуется корневая система, и получают готовые для пересадки саженцы.

Среднее число побегов в пучке после 1,5 мес. культивирования фрезий приведено в табл. 1„

Таблица 1

Сорт

4,0

3,26

4,55

82

114

Пример 2. Среду для выращвания фрезий готовят и опыт проводят как в примере 1. Состав среды, мг/л: Натрий фосфорнокислый двузамещенный172,0 Аммоний азотнокислый 1660,0 Кальций хлористый 445,0 Калий азотнокислый 1910,0 Магний се рнокислый 375,0 Калий фосфорнокислый однозамещен- ный171,0

10

5

20

25

30

5

0

5

0

5

Железо сернокислое28,0 Натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты37,4

Цинк сернокислый8,7 Борная кислота6,4 Марганец с-ернокислый22,5 Медь сернокислая0,025 Кобальт хлористый0,025 Натрий молибденово- кислый0,25 Калий йодистый0,85 Тиамин0,5 Пиридоксин0,б Витамин РР0,6 Натриевая соль лимонной кислоты70,0 Натриевая соль изо- лимонной кислоты70,0 Натриевая соль яблочной кислоты70,0 Глицин2,5 Аденин81,0 Гидролизат казеина$020,0 /5-Индо л илук с ус на я кислота3,0 Кннетин1,0 Гибберелловая кислота0,15 Сахароза35000,0 Агар11000,0 Выход побегов со средой Мурасиге- Скуга 4,69 шт.; выход побегов со средой с органическими кислотами 4,82 шт.; увеличение выхода: 103%.

Пример 3. Среду для выращивания фрезий готовят и опыт проводят по примеру 1.

Состав среды, мг/л: Натрий фосфорнокислый

двузамещенный169,0

Аммоний азотнокислый1640,0

Кальций хлористый435,0

Калий азотнокислый1850,0

Магний сернокислый365,0 Калий фосфорнокислый

однезамещенный169,0

Железо сернокислое27,5 Натриевая соль этилен- диаминтетрауксусной

кислоты37,2

Цинк сернокислый8,5

Борная кислота6,0

Марганец сернокислый22,0

Медь сернокислая0,024

Кобальт хлористый0,024 Натрий молибденовокислый0,24

5

10

Калий йодистый0,8 Тиамин0,3 Пиридоксин0,4 Витамин РР0,4 Натриевая соль лимонной кислоты20,0 Натриевая соль иэо- лимонной кислоты20,0 Натриевая соль яблочной кислоты20,0 Глицин1 ,5 Адения70,0 Гидролизат казеина980,0 р-Индолилуксусная15 кислота1,0 Кинетин 0,1 Гибберелловая кислота0,05 Сахароза20000,0 Агар8000,0 20 Выход побегов со средойМурасиге- куга 3,8 шт.; выход побегов со среой с органическими кислотами ,85 шт.; увеличение выхода: 101%,

Пример 4. Среду для выращи- 25 ання фрезий готовят и опыт провоят по примеру 1.

Состав сред, мг/мл: Опыт 1

Натрий фосфорнокислый30 двузамёщенный170,0 Аммоний азотнокислый1650,0 Кальций хлористый440,0 Калий азотнокислый1900,0 Магний сернокислый370,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный170,0 Железо сернокислое27,8 Натриевая соль этилен- диаминтетрауксусной кислоты37,3 Цинк сернокислый8,3 Борная кислота6,2 Марганец сернокислый22,3 Медь сернокислая0,025 Кобальт хлористый0,025 Натрий молибденово- кислый 0,25 Калий йодистый0,83 Тиамин0,4 П иридокс ин0,5 Витамин РР0,5 Калиевая соль лимонной кислоты66,6 Калиевая соль изо- лимонной кислоты66,6 Калиевая соль яблочной кислоты66,6

35

40

45

50

55

5

10

15 20 - - 25

30

35

40

45

50

55

8

Глицин 2,02,0 Аденин30,0 Гидролизат казеина1000,0 р-индолилуксусная кислота2,0 6-бензиламинопурин0,2 Гибберелловая кислота0,1 Сахароза30000,0 Агар10000,0 Опыт 2

Натрий фосфорнокислый двузамёщенный160,0 Аммоний азотнокислый1640,0 Кальций хлористый435,0 Калий азотнокислый1850,0 Магний сернокислый365,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный160,0 Железо сернокислое27,5 Натриевая соль этилен- диаминтетрауксусной i кислоты37,2 Цинк сернокислый8,5 Борная кислота6,0 Марганец сернокислый22,0 Медь сернокислая0,024 Кобальв1 хлористый0,024 Натрий молибденово- кислый0,24 Калий йодистый0,8 Тиамин0,3 Пиридоксин0,4 Витамин РР0,4 Калиевая соль лимонной кислоты20,0 Калиевая соль изо- лимонной кислоты .20,О Калиевая соль яблочной кислоты20,0 Глицин -1,5 Аденин79,0 Гидролизат казеина980,0 -Индолилуксусная кислота1,0 6-Бензиламинопурин0,1 Гибберелловая кислота0,05 Сдхароза20000,0 Агар8000,0 Опыт 3

Натрий фосфорнокислый

двузамёщенный170,0

Аммоний азотнокислый1650,0

Кальций хлористый440,0

Калий азотнокислый1900,0

Магний сернокислый370,0

Калий фосфорнокислый однозамещенный170,0 Железо сернокислое27,8 Натриевая соль этилен- диаминтетрауксусной кислоты37,3 Цинк сернокислый8,3 Борная кислота6,3 Марганец сернокислый22,3 Медь сернокислая0,025 Кобальт хлористый0,025 Натрий молибденово- кислый0,25 Калий йодистый0,83 Тиамин0,4 Пиридоксин0,5 Витамин Литиевая соль лимонной кислоты66,3 . Литиевая соль изо- лимонной кислоты66,3 Литиевая соль яблочной кислоты66,3 Глицин2,0 Аденин80,0 Гидролизат казеина1000,0 /5 -Инд о лил ук с ус на я кислота2,0 6-Бензиламинопурин0,2 Гибберелловая кислота0,1 Сахароза30000,0 Агар10000,0 Среднее количество побегов, в пуче после 1,5 мес. культивирования риведено в табл. 2.

Таблица 2

П р и м е р - 5. Среду готовят и опыт проводят по примеру 1 .

10

15

20

25

55898410

Состав среды, мг/л: Натрий фосфорнокислый двузамещенный170,0 Аммоний азотнокис5лый1650,0

Кальций хлористый440,0

Калий азотнокислый1900,0

Магний сернокислый370,0

Калий фосфорнокислый однозамещенный170,0 Железо сернокислое 27,8 Натриевая соль этиле ндиаминтетра уксусной кислоты 37,3 Цинк сернокислый 6,6 Борная кислота 6,2 Марганец сернокислый 22,3 Медь сернокислая 0,025 Кобальт хлористый 0,025 Натрий молибденово- кислый 0,25 Калий йодистый 0,83 Тиамин 0,4 Пиридоксин 0,5 Витамин РР 0,5 Натриевая соль лимонной кислоты 66,6 30 Натриевая соль изолимонной кислоты66,6

Натриевая соль яблочной кислоты66,6 Натриевая соль итако- новой кислоты 50,0 с -Кетоглутаровой кислоты натриевая соль 50,0 Глицин 2,0 Аденин 80,0 Гидролизат казеина 1000,0 -Индолилуксусная кислота 2,0 Кинетин О,2 Гибберелловая кислота 0,1 Сахароза 30000,0 Агар 10000,0 Выход побегов, по сравнению с известной средой 116%.

Пример 6. Среду готовят и опыт проводят по примеру 1 . Состав среды, мг/л: Натрий фосфорнокислый двузамещенный170,0 Аммоний азотнокислый 1650,0 Кальций хлористый 440,0 Калий азотнокислый 1990,0 Магний сернокислый 370,0

35

40

45

50

55

Калий фосфорнокислый однозамещенный170,0 Железо сернокислое27,8 Натриевая соль эти- лендиаминтетрауксус- ной кислоты37,3 Цинк сернокислый8,6 Борная кислота6,2 Марганец сернокислый22,3 Медь сернокислая0,025 Кобальт хлористый0,025 Натрий молибденово- кислый ,0,25 Калий йодистый0,83 Тиамин0,4 Пиридок с ин0,5 Витамин РР0,5 Натриевая соль лимонной кислоты66,6 Натриевая соль изо- лимонной кислоты66,6 Натриевая соль яблочной кислоты66,6 Натриевая соль итако- новой кислоты20,0 с(-Кетоглутаровой кислоты натриевая соль20,0 Глицин2,0 Аденин80,0 Гидролйзат казеина1000,О -Индолилуксусная кислота2,0 Кинетин0,2 Гибберелловая кислота0,1 Сахароза30000,0 Агар10000,0 Выход побегов, по сравнению с звестной средой 108%.

Пример 7. Среду готовят опыт проводят по примеру 1. Состав среды, мг/л: Натрий фосфорнокислый двузамещенный170,0 Аммоний азотнокислый1650,0 Кальций хлористый440,0 Калий азотнокислый1900,0 Магний сернокислый370,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный170,0 Железо сернокислое27,0 Натриевая соль этилен- диаминте траукс ус ной кислоты37,3 Цинк сернокислый8,3 Борная кислота6,2 Марганец сернокислый22,3 Медь сернокислая0,025

0

5

0

5

0

5

0

5

Кобальт хлористый0,025

Натрий молибденово- кислый0,25

Калий йодистый0,83

Тиамин0,4

Пиридоксин0,5

Витамин РР0,5

Натриевая соль лимонной кислоты66,6 Натриевая соль изо- лимонной кислоты66,6 Натриевая соль яблочной кислоты 66,6 Натриевая соль ита- коновой кислоты 70,0 «(-Кетоглутаровой кислоты натриевая соль 70,0 Глицин2,О Аденин 80,0 Гидролизат казеина1000,0 р-Индо л ил ук с ус на я кислота2,0 Кинетин 0,2 Гибберелловая кислота О,I Сахароза - 30000,0 Агар10000,0 Выход побегов по сравнению с контролем 107%.

Для получения 1 кг инозитала требуется 25,2 кг фитина медицинского. Источником фитина служат зерновые (кукуруза, гречиха), и максимальное содержание фитина в растениях может составлять несколько процентов по сухой массе. Замена инозита органическими кислотами позволяет на каждую тонну питательных сред сэкономить около 250 кг зерновых.

При использовании смеси органических кислот можно увеличивать количество побегов на 7-19%. Кроме того, смесь карбоновых кислот или их солей является универсальной добавкой, ее можно применить также в модифицированных средах, например при выращивании фрезий из меристем на упрощенной среде.

Среду готовят и опыт проводят по примеру 1.

Состав среды, мг/л: Натрий фосфорнокислый двузамещенный17 О, О

Аммоний азотнокислый 1650,0 Кальций хлористый440,0

Калий азотнокислый1900,0

Магний сернокислый370,0

Калий фосфорнокислый однозамещенный170,0

13

Железо сернокислое 27,8 Натриевая соль этилен- диаминтетрауксусной

кислоту37,3

Цинк сернокислый8,6

Борная кислота6,2

Марганец сернокислый22,3

Медь сернокислая0,025

Кобальт хлористый0,025 Натрий молибденовокислый0,25

Калий йодистый0,83

Тиамин0,5

Пиридоксин0,6

Аденин80,0

6-Бензиламинопурин0,6

Сахароза35000

Агар8000,

1558984

14

рН среды 6. Среду разделяют на три части и добавляют контроль без мезоинозита (среда I); 100 мг мезо- инозита (среда II); 200 мг смеси кар- боновых кислот Комплекс (среда III), с оде ржащую, мг:

Изо-лимоннЬй кислоты кальциевая соль66,6 Лимонной кислоты натриевая соль66,8 Яблочной кислоты натриевая соль 66,6

Влияние инозита и смеси карбоно- вых кислот на количество побегов фрезий в пучке после 1,5 мес. культивирования in vitro приведено в табл. 3.

Таблица 3

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию растительных тканей и клеток IN VITRO и касается приготовления новых составов питательных сред. Целью изобретения является увеличение выхода и улучшение роста побегов. Изобретение состоит в том, что мезоинозит, используемый при добавлении в питательную среду для последующего синтеза из него в растения карбоновых кислот, заменяют на введенные непосредственно в среду соли яблочной, лимонной и изолимонной кислот. Кроме того, в среду дополнительно вводят соли итаконовой и α-кетоглутаровой кислот. 1 з.п. ф-лы, 5 табл.

СортКоличество побегов фрезий в пучке,

шт,, на среде

I IIIII-X для

сорта

Fantasy2,82,23,42,8

Uchida4,54,14,54,4

Prominence4,83,45,74,7

х для среды4,03,34,6

Влияние инозита и смеси кар-фрезнй in vitro приведено в

боковых кислот на длину побеговтабл.4.

Таблица 4 СортДлина побегов фрезий, см, для среды

.«.-...-.- -..«...- «..-.....

IIIШх для

сорта

Fantasy4,87,44,95,7

Uchida2,42,82,32,5

Prominence6,57,17,57,0

х для среды4,65,84,9

Влияние инозита и смеси карбоно-тов фрезий in vitro приведено в

вых кислот на диаметр каллуса эксплан- табл. 5.

15

558984 б

Таблица 5

Сорт

7

Диаметр каллуса эксплантов фреэий, см

Среда с дестибиотином0 Среду готовят и опыт проводят по римеру 1.

Состав среды, мг/л: Натрий фосфорнокислый двузамещенной170,0 Аммоний азотнокислый1650,0 Кальций хлористый440,0 Калий азотнокислый1900,0 Магний сернокислый370,0 Калий фосфорнокислый однезамещенный170,0 Железо. Сернокислое27,8 Натриевая соль эти- лендиаминтетрауксус- ной кислоты37,3 Цинк сернокислый8,6 Борная кислота6,2 Марганец сернокислый22,3 Медь сернокислая0,025 Кобальт хлористый0,025 Натрий молибденово- кислый0,25 Калий йодистый0,83 Тиамин0,4 Натриевая соль лимонной кислоты66,6 Натриевая соль изо- лимонной кислоты66,6 Натриевая соль яблочной кислоты66,6 Дестиобиотин0,1 Аденин80,0 р-Индолилуксусная кислотаI,5 Кинетин1,О Сахароза18000,0 Агар8000,0 Длина побегов в контроле в среднем 4,7 мм; длина побеговв опыте В0 мм; прирост 6%.

Формула изобретения

5

0

J. Питательная среда для выращивания фрезий in vitro, содержащая натрий фосфорнокислый двузамещенный, аммоний азотнокислый, кальций хлористый, натрий ЭДТА, калий азотнокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, железо сернокислое, цинк сернокислый, борную кислоту, марганец сернокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, натрий молибденовокислый, калий йодистый, тиамин, пиридоксин, витамин РР, глицин, аденин, гидролизат казеина, ауксин, цитокинин, гибберел- лоэую кислоту, сахарозу, агар, ис- c точник карбоновых кислот и воду, отличающаяся тем, что, с целью увеличения выхода и улучшения роста побегов, в качестве источника карбоновых кислот используют соли лимонной, изо-лимонной и яблочной кислот при следующем соотношении компонентов, мг/л:

Натрий фосфорнокислый двузамещенный Аммоний азотнокислый

Кальций хлористый Натриевая соль этиле ндиаминтетрауксус- ной кислоты Калий азотнокислый

Магний сернокислый

Калий фосфорнокислый однозамещенный Железо сернокислое Цинк сернокислый Борная кислота

0

5

0

5

169-172

1640-1660 435-445

37,2-37,4

1850-1910

365-375

160-171

27,5-28,0

8,5-8,7

6,0-6,4

17

Марганец сернокислый

Медь сернокислая Кобальт хлористый Натрий молибдено- вокислый Калий йодистый Тиамин Пиридоксин Витамин РР Соль лимонной кислоты

Соль изо-лимонной кислоты

Соль яблочной кислоты

58984 8

Глицин Аденин

Гидролизат ,казеина Ауксин Цитокинины Гибберелловая кислота

Сахароза Агар Вода

10

1,5-2,5 79-81 980-1020

1-3 0,1-1,0

0,05-0,15 20000-35000 8000-J1000 Остальное

2. Питательная среда по п. 1, отличающа яс я тем, что дополнительно содержит, мг/л: соль итаконовой кислоты 20-70 и соль е(-кетоглутаровой кислоты 20-70.