Ингибитор протеолиза Советский патент 1990 года по МПК A61K38/55 

Изобретение относится к медицине, а конкретно к медицинской биохимии, может быть использовано в биохимии, экспериментальной кардиологии, терапии, и касается средств, ингибирующих протеолитические ферменты.

Цель изобретения - выявление средства, ингибирующего протеолиз, пептидной природы, получаемого синтетическим путем.

Пример 1. В работе используют следующие препараты: трипсин (Спофа, ЧССР), химотрипсин и андекалин (отечественные препараты), калликреин плазмы крови человека, выделенный и очищенный по известному методу; бра- дикинин-триацетат (Реанал, ВНР), контрикал (VEB, ГДР). Для определения активности протеиназ используют в качестве субстрата К-бензоил-Ь-аргинин этиловый эфир (БАЭЭ, Реанал, ВНР). Молекулярный вес каждого фермента определяют гель-хроматографией на се- фадексе-С-100.

Взаимодействие брадикичина и конт- рикала с протеиназами изучают с помощью кинетического анализа. Ферменты инкубируют с ингибитором в течение 15 мин, используя следующие концентрации: растворов ферментов ( ), брадикинина (10 -Ю 4 М), контрикала ( Ю г-1 0 %), БАЭЭ (2хЮ- 1x10 М). Затем измеряют БАЭЭ - эсте- разную активность фермента в присутствии и отсутствии ингибитора, строят графики в координатах Михаэлиса и Лайнуивера-Бэрка, определяют К и V а. Для определения эффективной дозы брадикинина и контрикала для трипсина и химотрипсина определяют I$v т.е. концентрацию ингибитора, снижающую скорость БАЭЭ - эстеразной реакции на 50%. На основании этих данных рассчитана I -доза: для брадикинина - 1 мкМ и контрикала - 100 мкМ. Таким образом, эффективная концентрация брадикинина в качестве ингибитора трипсина и химотрипсина

Ып

ел

QO

СО

ьэ

100 раз меньше, чем контрикала.

Брадикинин конкурентно ингибиро- ал БАЭЭ-эстеразную активность анде- алина, калликрейна плазмы крови че- . овека с К- 5,2х10 М; 2,4х10-7М соответственно, и являлся неконкуентным ингибитором для трипсина и химотрипсиН-а, снижая VMfl|)ce на 50%. Контрикал, взаимодействуя с трипси- JQ ном, химотрипсином, андекалином и калликреином плазмы, обладал свойствами неконкурентного ингибитора.

Таким образом, орадикинин можно использовать как специфический конку- 5 рентный ингибитор калликрейна плазмы и тканей в биохимических исследованиях при изучении взаимодействия активного центра протеиназ с эффекторами .20

Пример 2. Для выявления характера действия брадикшшна в организме изучают активность калликрейна плазмы крови мышей и его предшественника при внутривенном введении пре- 25 парата.

Брадикинин триацетат, приготовленный на физиологическом растворе, вводят в хвостовую вену мышам линии BAIB/c. Доза препарата 1 мг/кг массы зд пересчитана по эффективной дозе, най- денной в предыдущей серии. Контрольным животным вводили физиологический раствор. Через 2,6 ч,1,3,7 сут. после введения брадикинина определяют активность калликрейна и калликреино- гена плазмы крови мышей. Результаты этого исследования представлены в табл. 1.

Снижение активности калликреиноге- Q на и калликрейна плазмы крови мышей наблюдалось в течение 6 ч после введения брадикинина. Наиболее значительное торможение активности калликрейна (на 47%) происходило через 4 ч, де активность калликреиногена, предшественника фермента, подавлена на 56- 67% через 1-6 ч,после инъекции препарата мышам.

Таким образом, введение брадики- „ нина мышам линии BAIB/c также как в условиях in vitro вызывает подавление активности калликрейна и калликреиногена плазмы крови. Более значительный эффект характерен для пред- шественника фермента.

Пример 3. В опытах используют беспородных белых крыс самцов массой 150-180 г. Брадикинин-триацетат (ВНР)

35

5 0

5

Q е

„

5

вводят в хвостовую вену в дозе 1 мг/кг массы, контрольным животным вводили физиологический раствор. Через 2,6 ч, 1,3,7 сут. после введения брадикинина определяют активность катепсина D печени и сердца. Свободную и общую активность фермента определяют в отсутствии и присутствии О, 1%-ного раствора тритора Х-100 соответственно по расщеплению гемоглобина и выражают в нмоль тирозина/мг белка в 1 мин по методу Аксона.

В условиях in vitro добавляют 1 мкМ брадикинина в среду инкубации гомогенатов печени и сердца в процессе определения активности катепсина D. Данные этих опытов представлены в табл. 2.

При инкубации с брадикинином более значительно снижалась активность катепсина D сердца, чем печени: свободная - на 40 и 29%, общая - на 32 и 25% соответственно.

В результате изучения активности катепсина D печени и сердца в условиях in vivo было показано, что при внутривенном введении брадикинина крысам происходило уменьшение активности фермента сердца и печени на 20- 40% по сравнению с контролем в течение 24,ч, а затем наблюдалось восстановление. Следует отметить, что более существенное подавление активности катепсина D брадикинином характерно для сердечной мышцы.

П р и м е р 4. Инфаркт миокарда моделируют путем перевязки левой коронарной артерии. Брадикинин и конт- рикал вводят через 1 ч после операции внутривенно в дозах 1 мг/кг и 7500 ед/кг массы соответственно. Через 1 сут. после операции крыс дека- питируют, извлекают сердце и печень, готовят гомогенаты в отношении 1:10 на охлажденном 0,25 М растворе сахарозы (рН 7,4). В гомогенатах определяют общую и свободную активность катепсина D.

Результат опытов по изучению активности катепсина D в органах при введении брадикинина и контрикала на фоне инфаркта миокарда представлены в табл. 3. При инфаркте миокарда у крыс происходят значительные изменения активности катепсина D в ткани сердца.. Через 1 сут. после перевязки коронарной артерии наблюдалось увеличение свободной активности

атепсина D в 1,7 раза, а общей - в 1,4 раза. В печени, не. подвергавшейся повреждению, отмечено несущественное возрастание свободной активности фермента. Брадикинин и контрикал, введенные через 1 ч после окклюзии венечной артерии, подавляют свободную активность катепсина D сердца на 49 и 41%, -а общую активность на 30 и. 37% соответственно. В печени при введении брадикинина наблюдалось снижение активности катепсина D: свободной - на 19%, общей - на 16%. При введении контрикала- происходит несущественное увеличение свободной и снижение общей активности фермента - на 17%.

Следовательно, брадикинин, также как контрикал, обладает отчетливым

5

ингибирующим действием на протеолити- ческую активность катепсина D при инфаркте миокарда у крыс, особенно в поврежденной ткани сердца.

Изобретение позволяет выявить препарат пептидной природы, конкурентно ингибирующий активность калликреина, обладающий свойствами ингибитора про- теолиза при экспериментальном инфаркте миокарда. Эффективная концентрация брадикинина в 100 раз меньше, чем контрикала, используемого в терапии, кардиологии для ингибирования протеолиза.

Формула изобретенная Применение брадикинина в качестве ингибитора протеолнза для экспери- ментальных исследований. Таблица 1

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в биохимии, экспериментальной кардиологии, терапии. Целью изобретения является выявление средства, ингибирующего протеолиз, пептидной природы, получаемого синтетическим путем. Для ингибирования протеолиза в экспериментальных исследованиях используют брадикинин. Изобретение позволяет выявить препарат пептидной природы, конкретно ингибирующий активность калликреина, обладающий способностью подавлять протеолитические процессы при экспериментальном инфаркте миокарда. 3 табл.

В скобках указано число опытов. - Достоверные изменения.

Примечание. Представлены данные 6 опытов.

Таблица2

ТаблицаЗ