Способ определения активности трипсина Советский патент 1987 года по МПК C12Q1/38 G01N33/48 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения активности трипсина и его ингибитора, и может быть использован в медицине для определения трипсина в диагности чеёких целях.

Цель изобретения - ускорение и по вьшение чувствительности способа за счет использования в качестве субстрата поверхностно-модифицированного фпюоресцирующим реагентом - дансил- хлоридом (диметиламинонафталинсуль- фонилхлоридом) ультратонкого слоя желатина.

Способ осуществляется следующим образом.

. Фотопластинки засвечивают, проявляют фиксируют и обрабатывают раствором дансилхлорида в смеси ацетон - бикарбонатныЙ буфер 9:1, последовательно промывают в ацетоне, спирте, воде и высушиваюто

Исследуемый препарат наносят на фиксированную и .высушенную поверхность желатинового слоя фотопластинки, затем инкубируют во влажной камере После инкубации пластинки тщателно промывают и просматривают в ультрафиолете, регистрируя зоны лизиса в виде темных пятен на фоне желто- зеленой флюоресценциио

Для количественного определения трипсина в ряд проб с различным разведением трипсина добавляют известное количество ингибитора трипсина, инкубируют смесь и наносят на пластинки. Затем проводят инкубацию во влажной камере и определяют количество трипсина по степени проявления зон лизированного желатина.

Пример 1. Обработка фотопластинок „

Фотографические пластинки (микрат СК размером см или пластинки для ядерных исследований размером см) засвечивают, проявляют на свету, фиксируют, тщательно промывают водой, промывают в течение 60 мин в зтиловом спирте с трехкратной сме

всей толщи желатина, включая основной немодифицированный дансилхлоридом слой желатина, наблюдается в точке 100 нг/мкл трипсина Разная степень лизиса только модифицированного слоя желатина наблюдается в точках 0,1- 10 нг/мкл трипсина; в случае других ферментов лизис наблюдается в точках 10-100 нг/мкл. Эти данные свидетельст-i вуют о том, что подготовленный описанным вьш1е способом слой желатина избирателен и специфичен к трипсину.

ной спирта, промывают 60 мин в ацето-50 но не к другим апробированным ферменне с трехкратной его сменой. Полностью высушенную пластинку помещают .на 5 ч в 0,5%-ный раствор дансилхлорида в смеси ацетон - О,1М NaHCO (9:1), затем промывают в течение 30 мин в ацетоне с трехкратной сменой,. 30 мин в спирте с трехкратной сменой и в течение 1 ч в воде с шес55

там. При этом максим.альная чувствительность пластинок к трипсину составляет 0,1 нг/мкл„

Пример 2. Количественное ол- ределение активности трипсина и конт- рикапа,

В примере представлены данные по титрованию ингибитора трипсина

5

0

5

0

5

0

5

тикратной сменой, затем высушивают на воздухе Полученные таким способом готовые к употреблению пластинки упаковывают эмульсионными слоями , друг к другу и хранят (срок хранения приготовленных таким образом пластинок составляет не менее шести месяцев) о

Для получения пластинок с обозначенными полями фотопластинку зкспо- нируют под сеткой с обозначенными светлыми полями размером мм и черными линиями толщиной 0,5 мм. Далее фотопластинку проявляют, фиксируют и модифицируют дансилхлоридом, как описано вьшзео Подготовленные таким образом пластинки с 320 полями многократно используются для анализов до исчерпания свободных полей.

Определение чувствительности пластинок к разным протеолитическим активностям.

Пробы ферментов трипсина, химо- трипсина, папаина (каждая объемом в 10 мкл) в 0,1М фосфатном буфере, рН 7,6, и пепсина в 0,1М СНзСООН, содержащие 0,1; 1,0; 10; 100 нг/мкл фермента, наносят в виде капли на поверхность подготовленных пластинок и влажной камере 60 мин

течение 1 мин водой, помещают в спиртовой раствор . на 1 мин, затем высушивают 1 мин и визуализируют под ультрафиолетовой . лампой. На фоне интенсивной желто- зеленой флуоресценции обнаруживают , черные точки лизиса. Полный лизис

всей толщи желатина, включая основной немодифицированный дансилхлоридом слой желатина, наблюдается в точке 100 нг/мкл трипсина Разная степень лизиса только модифицированного слоя желатина наблюдается в точках 0,1- 10 нг/мкл трипсина; в случае других ферментов лизис наблюдается в точках 10-100 нг/мкл. Эти данные свидетельст-i вуют о том, что подготовленный описанным вьш1е способом слой желатина избирателен и специфичен к трипсину.

выдерживают во

при 20 С, промывают в

0 но не к другим апробированным фермен

там. При этом максим.альная чувствительность пластинок к трипсину составляет 0,1 нг/мкл„

Пример 2. Количественное ол- ределение активности трипсина и конт- рикапа,

В примере представлены данные по титрованию ингибитора трипсина 31320224

контрикала (CONTRYCAL, VEB ARZNEIMIT- TELWERK, DRESDEN) трипсином (трипсин кристаллический СПОФА, ЧССР) с актив- ностью, равной 7500 ЕД/мг БАЭЭ, и раздельно трипсином фирмы KOCH-LIGHT 5 LAB.LTO (Англия, трипсин панкреатический, 3-кратнокристаллизированный).

В 20 полиэтиленовых ампул (типа Эпендорф). разливают по 100 мкл.0,1 М Na-фосфатного буфера, рН 7,6, содер- жащего 5 нг/мкл контрикала. В первые 10 ампул добавляют возрастающие количества (от 10 до 100 мкл) трипсина (СПОФА)в воде в концентрации 10 нг/мкл.

более точный расчет активност ей конт- рикала и трипсина фирмы КЬСН-LIGHT (соответственно 5400-5475 антитрипси- новых ЕД/мг БАЭЭ и 9750-9970 ЕД/мг БАЭЭ)„

Пример 3„ Измерение трипсин- ингибиторного баланса в крови.

100 мкл свежеполученной плазмы крови кролика разбавляют в 10 раз в 0,2 М натрийфосфатном буфере, рН 7,6, разливают в 10 полиэтиленовых ампул по 100 мкл. В каждую пробу добавляют возрастающие количества (от 1 до 10 мкл) раствора трипсина в воде

В той же последовательности в ампулы 5 (ю нг/мкл) и воду от 9 до О мкл, и

добавляют воду (от 100 до 10 мкл) для

получения одинакового объема (210 мкл). ю мкл из каждой пробы наносят на С остальными ТО ампулами повторяют пластинку (остальную часть проб хра- описанную операцию с той разницей, нят при 4 с). Пластинку выдерживают что используется трипсин фирмы КОСН- 20 30 мин во влажной камере, промыва- LIGHT. Смесь перемешивают, оставляют при 60 мин, затем па 10 мкл наносят на пластинку (остальную часть проб хранят при ), выдерживают во

влажной камере 330 мин, промывают во-25 подавлена, а в пробах 7-10 трипсин дои 1 мин, затем спиртом 1 мин, высу- проявляет активность. С учетом этих, шивают на воздухе и визуализируют под УФ-излучениемо При этом обнаруживается , что в опыте с трипсином СПОФА в пробах 1-7 активность подавлена, а 30 в пробах 8-10 есть лизис. С трипси- .ном фирмы KOCH-LIGHT активность выражена в пробах .6-10. На этом этапе

инкубируют при 4 С 30 мин Далее по

ют водой 1 мин, спиртом 1 мин, высушивают на воздухе и визуализируют под ультрафиолетом. Обнаруживается, что в пробах 1-6 активность трипсина

данных проводят оценку протеиназно- ингибиторного равновесия. При необходимости повышения точности анализа в зоне титрования 6-7 повторяют опыт. Оставшуюся часть проб 6 делят на 10 частей по 10 мкл каждая, добавляют по 1 мкл 1 М фосфатного буфера рН 7,6, затем в пробы добавляют воз- 35 растающие количества (от 1 до 10 мкл) раствора трипсина (1 нг/мкл) и от 9 до О мкл воды, инкубируют 30 мин при , по 10 мкл от каждой пробы наноуже можно грубо оценить как ингиби- рукмцую активность контрикала, так и трипсина фирмы KOCH-LIGHT. Проведенные расчеты показывают, что активность контрикала находится в пределах 5250-6000 антитрипсиновых ЕД/мг

данных проводят оценку протеиназно- ингибиторного равновесия. При необходимости повышения точности анализа в зоне титрования 6-7 повторяют опыт. Оставшуюся часть проб 6 делят на 10 частей по 10 мкл каждая, добавляют по 1 мкл 1 М фосфатного буфера рН 7,6, затем в пробы добавляют воз- 35 растающие количества (от 1 до 10 мкл) раствора трипсина (1 нг/мкл) и от 9 до О мкл воды, инкубируют 30 мин при , по 10 мкл от каждой пробы наноФормула изобретения

сят на пластинку, выдерживают 30 мин,

БАЭЭ. Активность трипсина (KOCH-LIGHTX 40 промьшают водой, спиртом, сушат и ви- равна 8800-12000 ЕД/мг БАЭЭ. При не- зуализируют под ультрафиолетом, обходимости повышения точности анализа в зоне титрований 7-8 и 5-6 повторяют опыт. Оставшиеся части пробы 7 (трипсин СПОФА) и пробы 5 (трипсин 5 KOCH-LIGHT) делят на 10 частей по 20 мкл, добавляют возрастающие объемы растворов трипсинов (от 1 до 10 мкл, концентрация 1 , трипсин СПОФА- в аликвоты пробы 7, трипсин фирмы KOCH-LIGHT - в аликвоты пробы 5) и

1.Способ определения активности трипсина путем нанесения пробы на фиксированную и высушенную поверхность желатинового слоя фотопластины, инкубации во влажной камере, про- 50 мьшания водой с последующим визуальным определением наличия активности по участкам лизированного желатина, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения чувствительности способа, фотопластину предварительно засвечивают, перед фиксацией фотопластину проявляют, затем Обрабатывают раствором дансилводы (от 9 до О мкл), оставляют при на 60 мин. По 10 мкл из каждой пробы наносят на пластинку и дальше поступают, как описано вьш1е.В результате обнаруживается, что лизис имеется в точках 7.3-7.10 и 5.6-5.10, На основе этих данных можно провести

более точный расчет активност ей конт- рикала и трипсина фирмы КЬСН-LIGHT (соответственно 5400-5475 антитрипси- новых ЕД/мг БАЭЭ и 9750-9970 ЕД/мг БАЭЭ)„

Пример 3„ Измерение трипсин- ингибиторного баланса в крови.

100 мкл свежеполученной плазмы крови кролика разбавляют в 10 раз в 0,2 М натрийфосфатном буфере, рН 7,6, разливают в 10 полиэтиленовых ампул по 100 мкл. В каждую пробу добавляют возрастающие количества (от 1 до 10 мкл) раствора трипсина в воде

(ю нг/мкл) и воду от 9 до О мкл, и

ю мкл из каждой пробы наносят на пластинку (остальную часть проб хра- нят при 4 с). Пластинку выдерживают 30 мин во влажной камере, промыва-

инкубируют при 4 С 30 мин Далее по

ю мкл из каждой пробы наносят на пластинку (остальную часть проб хра- нят при 4 с). Пластинку выдерживают 30 мин во влажной камере, промыва-

подавлена, а в пробах 7-10 трипсин проявляет активность. С учетом этих,

ют водой 1 мин, спиртом 1 мин, высушивают на воздухе и визуализируют под ультрафиолетом. Обнаруживается, что в пробах 1-6 активность трипсина

подавлена, а в пробах 7-10 трипсин проявляет активность. С учетом этих,

данных проводят оценку протеиназно- ингибиторного равновесия. При необходимости повышения точности анализа в зоне титрования 6-7 повторяют опыт. Оставшуюся часть проб 6 делят на 10 частей по 10 мкл каждая, добавляют по 1 мкл 1 М фосфатного буфера рН 7,6, затем в пробы добавляют воз- астающие количества (от 1 до 10 мкл) раствора трипсина (1 нг/мкл) и от 9 о О мкл воды, инкубируют 30 мин при , по 10 мкл от каждой пробы наноФормула изобретения

промьшают водой, спиртом, сушат и ви- зуализируют под ультрафиолетом,

40 промьшают водой, спиртом, сушат и ви- зуализируют под ультрафиолетом, 5

5

1.Способ определения активности трипсина путем нанесения пробы на фиксированную и высушенную поверхность желатинового слоя фотопластины, инкубации во влажной камере, про- 50 мьшания водой с последующим визуальным определением наличия активности по участкам лизированного желатина, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения чувствительности способа, фотопластину предварительно засвечивают, перед фиксацией фотопластину проявляют, затем Обрабатывают раствором дансил513202246

хлорида в смеси ацетон - бикарбонат-чественного определения трипсина, в

ный буфер 9;1, последовательно промы-ряд проб с различным разведением

вают в ацетоне, спирте, води и высу-трипсина добавляют известное колишивают, а наличие участков лизирован чество ингибитора трипсина, смесь

него желатина определяют в ультра- 5инкубируют, наносят на пласфиолете в виде темных пятен на фонетинки, а количество трипсижелто-зеленой флюоресценции.на определяют по степени

2. Способ по По 1, о т л и ч а -проявления зон лизированного

ю ц и и с я тем, что, с целью коли-желатина.

Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - ускорение и повышение чувствительности способа. Фотопластинки засвечивают, проявляют, фиксируют и обрабатывают раствором дансилхлорида в смеси ацетона с бикарбонатным буфером Промывают в ацетоне, спирте, воде и высушивают. Исследуемый препарат наносят на фиксированную и высушенную поверхность желатинового слоя фотопластинки, инкубируют. Пластинки промывают и просматривают в ультрафиолете, регистрируя зоны лизиса. В ряд проб с различным разведением трипсина добавляют известное количество ингибитора трипсина, инкубируют смесь и наносят на пластинки Количество трипсина определяют по степени проявления зон лизиро- ванного желатинао Максимальная чувствительность пластинок к трипсину составляет 0,1 нг в 1 мкл. 1 з.п.ф-лы. с (Л оо I4D О ю ю NU