Способ определения уровня гибридности семян кукурузы Советский патент 1990 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к селекции и семеноводству, и может быть использовано научными и научно-производственными учреждениями при создании гибридов кукурузы и в процессе контроля их семеноводства.

Целью изобретения является повьше- ние точности определения.

Способ состоит в том, что экстракцию белка из эндосперма кукурузы осуществляют с помощью 69-70%-ного изо- .пропанола в течение 50-80 мин при 35-65°С, что позволяет разделить белки на 5 групп: А/В, С, D, Е, с последующим определением относительной электрофоретической подвижности каждого белкового компонента, учитывая расстояние от старта, пройденное

перными характерными компонентами

и .

П р и м е р . Используют гибридные композиции:

1)У ВИР 157ТС X cf ВИР 1583Т - гибрид Прогресс ТВ.

2)$ ВИР 40ТС X о С 103-ЗТ - гибрид Краснодарский ПГ-201 ТВ.

3) 05092 ТС - о А 44-ЗТ - гибрид Луна ТС.

4) 7Г-23 ТВ X « W155 - гибрид Краснодарский ЗТВ.

5) ВИР 38 ТС « ВИР 116 ЗТ - гибрид Звезда ТС.

От аерновки, противоположной зародышу, отделяют участок эндосперма массой 50-70 мг, измельчают на микроизмельчителе, заливают 150 мкл .65%-ного изопропанола, перемешивают

СП

со ел

и ставят на водяную баню на 60 мин при 60 С. Центрифугируют при SOOOg в течение 10 мин. Из надосадочной жидкости берут аликвоту в 50-60 мкл и упаривают досуха под феном. Белок растворяют в 25-30 мкл раствора, содержащего 8 М мочевины, 0,6% уксусной кислоты, 5% 2-меркаптоэтанола и 20% сахарозы и после прогрева на кипящей водяной бане в течение 5 мин наносят на дорожку геля.

Электрофорез проводят в 10%-ном полиакриламидном геле в уксуснокисло системе, содержащей 8 М мочевины, в геле толщиной 1 мм с кармана ми 1 см. После окончания электрофореза гель фиксируют в течение 30 мин в 10%-ном растворе трихлоруксусной кислоты, окрашивают 0,001. раствором кумас си R - 2.50 в течение 1,5-2 ч и замеряют относительную электрофоретичес- кую подвижность (ОЭП) белковых компонентов, определив расстояние от стар

та двух реперных В и , , Последние легко идентифицируются на электрофо- реграммах, являясь нижними.компонентами двух самых мощных сдвоенных компонентов. Определив ОЭП всех компонентов, объединяют их в группы в соответствии с их ОЭП: А-группа включает компоненты с ОЭП от О до 35, В-группа - с ОЭП от 36 до 42, С-груп- па.- от.43 до 48; D-rpynna - от 49 до 56 и Е-группа - от 57 до 100, На основании подобного анализа электро- ферограмм составляют белковые формулы для гибридов и их родительских линий. После электрофоретического анализа 100 зерновок гибрида и сравнения их формул с формулами родителе подсчитывают уро.вень гибридности (количество гибридных зерен) для кажд.о- .го гибрида. При этом следует помнить что гибридным считается такое зерно, зеиновый спектр которого включает все позиции белковых компонентов отцовской и материнской линии,

В табл, 1 приведены в качестве примера зеиновые (белковые) формулы гибрида Краснодарский 1У1Г-201 ТВ и его родительских линий. Уровень его . гибридности составил 7.4%, т,е, из 100 проанализированных -зерен только 74 имели в своем наборе все компо

0

5

5

D

5

40

45

50

55

ненты материнской и отцовской линий, остальные 26 зерен имели только материнскую формулу и, следовательно, получены бьши в результате самоопыления,

В табл, 2 представлены эксперимен- {тальные данные по различному соотношению трех важнейших факторов при извлечении зеиновых белков: концентрация изопропанола, время зкстракции и Температура, Видно, что оптимальными данные параметры были при 60-70% изопропанола, времени 50-80 мин и температуре 55-65°С, При этом количество компонентов в составе зеина, извлеченных из эндосперма, было максимальным.

Использование предложенного способа определения уровня гибридности семян кукурузы по сравнению с существующим имеет следующие преимущества: позволяет проводить оценку гибридности даже в случае, если родительские линии очень близки по.происхождению; благодаря разработанной номенклатуре записи данных о генотипе в виде зеиновых (белковых) формул возможно вводить и хранить сведения о гибридных комбинациях в памяти ЭВМ (создать банк данных по всем гибридным комбинациям) ,это позволит выявлять также происхождение примесей (инородного генетического материала) в каждой конкретной зоне семеноводческих хозяйств; . изобретение позволяет сохранить селекционньй материал для получения потомства.

Формула изобретения Способ определения уровня гибридности семян кукурузы, включающий экстракцию зеина и его электрофорети- ческое разделение с последующим анализом полученных электрофореграмм, отличающийся тем, что, с - целью повышения точности определения, экстракцию зеина проводят 60-70%-ным изопропанолом в течение 50-80 мин при 55-65°С и.при анализе фореграмм белковые компоненты группируют в соответствии с их относительной электро- форетической подвижностью, приняв за внутренний стандарт наиболее характерные компоненты В и ,

Т а б л И Ц а 1

ОбразцыГруппы компонентов, ОЭП.

t1. J...I

ВИР:40:ТС 16. 18. 20, 27, 32 ,38; 40 44. 47 49, 5зГ56 6оГб7Г7оГ

Гибрид Красно-, 7ft, 76, 92

дарений

ПГ-201ТВ16. 18. 20. 27. 29. 38. 40 44. 47 49. 53. 56 60. 63; 67

70, 74. 76. ,

О 44. 47 49. 53. 56 II 63. 67 76

..

Тавлицяа

:ловия-- --- .

экстракции 03njtoMnoHeHTOH

---1-: 1:..

S5Z иэопропй- 1JJJJ.

иола при

. --+

55Z иаопропа- + +-++...

иола при

60 С, U5 мин - , -+.

55Х иэопропп- +-

Пола при ..

65 С, - - t + .

55Z иэопроПА- + -.

KOJIS при

, 50мчи - - t .

60Z нзоиропл- « + +

поле при

65°С, SOm.- 4.

701 иэопропя-

Hojia при

55 С, 50 ник

70Х изопропа- .

попа при.

65 с, 80 НИН

70 изопроп.-

Нола при

55 С,80нин

60Х изопропа-

нолл прк

554, 50мии

75 изопропа-

нола при

, 50мин

75Х изопропа-

нпла при

70 С,50мя|1 - .

75Х изопропа- -.

ноле при

°:5:...:......:i..i... „ -

/

Составитель В.Демкин

.. корректор м.шарош

п г т р ЛзГ одпйсн Г ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Пагент гУужгородГулГг1г1рйн1поГ

Изобретение относится к области биотехнологии и касается определения степени гибридности F 1 кукурузы. Настоящий способ может успешно применяться в семеноводстве кукурузы. Целью изобретения является повышение точности определения уровня гибридности. Способ состоит в том, что зеин экстрагируют 60-70%-ным изопропанолом в течение 50-80 мин при температуре 55-65°С, затем осуществляют их электрофоретическое разделение, после чего компоненты группируют относительно реперных В 40 и С 47. 2 табл.