СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ГИБРИДНОСТИ СЕМЯН ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР Российский патент 1995 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к селекции и семеноводству, и может быть использовано научными и научно-производственными учреждениями при создании гибридов сельскохозяйственных растений и в процессе контроля их семеноводства.

Известен способ определения гибридности семян путем их высева в почву с последующим анализом взрослых растений по морфологическим признакам (Вожда с соавт. 1965; Югенхеймер, 1979).

Однако этот способ неэкономичен и малопроизводителен.

Более приемлемыми способами, сокращающими время анализа и удешевляющими весь процесс, являются электрофоретические методы (Перуанский, Духнов, 1984; Конарев с соавт. 1990; Попереля с соавт. 1989; авт. св. N 1542490).

Однако использование в данных методах растворов этанола и экстракция белков из зерна при комнатной температуре снижают их эффективность и не позволяют группировать полипептиды в четкие группы по их мобильности.

Известен способ определения уровня гибридности семян кукурузы [1] который лишен перечисленных выше недостатков. Однако он все-таки является довольно трудоемким и низкопроизводительным. А в связи с тем, что данный способ, который принят за прототип, основан на анализе белков из индивидуальных зерновок, определение гибридности семян затруднено, если родительские формы представлены не гомогенными линиями.

Основным недостатком прототипа является то, что он неприменим для установления уровня гибридности сложных гибридов. И наконец, следует отметить что данный способ разработан только для анализа семян кукурузы.

Целью изобретения является расширение возможности и повышение эффективности при определении гибридности семян.

Это достигается тем, что для анализа используют белковые вытяжки из большого количества размолотых семян. При этом электрофоретическому разделению подвергаются не только белки, выделенные из гибрида и его родительских форм, но также из искусственной смеси последних. Для получения дальнейшей информации гели сканируют на денситометре и уровень гибридности определяют путем сравнения отношения содержания реперных и характерных для данного гибрида полипептидов и смеси родительских форм, взятых в соотношении 1:1.

Существенные признаки прототипа, общие для него и заявляемого объекта исследования, следующие:
извлечение белков раствором изопропанола при нагревании,
проведение электрофореза в полиакриламидном геле с последующим группированием полипептидов согласно их электрофоретической подвижности.

Предлагаемый способ отличается от прототипа следующим:
экстракцию белков ведут одновременно из большого количества размолотых зерен (50-200 шт.);
электрофорезу подвергают белки, полученные из искусственной смеси родительских форм, взятых в соотношении 1:1;
после завершения электрофореза определяют относительное содержание реперного и характерного полипептидов для данного образца по площадям пиков денситограмм;
уровень гибридности находят по формуле, основу которой составляет отношение содержания реперного к характерному полипептидам гибрида и искусственной смеси его родительских форм.

П р и м е р 1. Используют простые гибридные комбинации кукурузы (двухлинейные гибриды). Из зерновых удаляют зародыши. Для анализа размалывают по 50 эндоспермов каждой родительской линии отдельно, 100 эндоспермов гибрида, а для получения смеси берут по 50 эндоспермов одной и другой родительской линии (в сумме 100 эндоспермов). Из каждого образца отвешивают в центрифужные пробирки по 200 мг муки. Для родительских линий в 2-3 пробирки, для гибрида и смеси родительских линий в 7-10 пробирок. В каждую пробирку приливают по 600 мкл 65%-ного изопропанола, перемешивают, нагревают на водяной бане в течение 1 ч при 60^оС. Затем центрифугируют при 5000 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают и упаривают досуха под феном. Полученный осадок растворяют в 100 мкл раствора, содержащего 8 М мочевины, 0,6% уксусной кислоты, 5% 2-меркаптоэтанола и 10% сахарозы, и после прогревания полученной смеси на кипящей водяной бане в течение 5 мин наносят на дорожку геля раствор в объеме 15-20 мкл.

Электрофорез проводят в 10%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в уксусно-глициновой системе, содержащей 8 М мочевины (Попереля с соавт. 1989) в приборе АВГЭ-2 (объединение "Хийу Калур", Эстония) в геле толщиной 1 мм с 0,5 мм карманами в течение 4,5 ч при напряжении 400 В.

После окончания электрофореза гели фиксируют в 10%-ном растворе трихлоруксусной кислоты (ТХУ), а затем окрашивают 0,005%-ным раствором кумасси G-250, приготовленным на 10%-ном растворе ТХУ, в течение 2-2,5 ч. Замеряют относительную электрофоретическую подвижность (ОЭП) полипептидов, приняв за точку отсчета верхнюю границу геля, а за реперные полипептиды компоненты В₄₀ и С₄₇ (авт. св. N 1595407). На фиг. 1 в качестве примера представлена фотография геля белков гибрида Краснодарский ПГ-201 ТВ и его родительских линий. Затем дорожки гелей с разделенными белками из гибрида и смеси его родительских линий сканируют на денситометре и определяют площади пиков на денситограммах. Последние являются числовым выражением относительного содержания соответствующих полипептидов. Реперными и характерными полипептидами для гибрида Краснодарский ПГ-201 ТВ являются С₄₇ и D₅₃; для гибрида ИК 28-8ТСХ ИК 65-1 ЗТ С₄₇ и D₅₁; для гибридов F₇ТСХ ИК 65-1 ЗТ и ZPSC-704 В₄₀ и D₅₁ соответственно.

На фиг. 1 изображено электрофоретическое разделение спирторастворимых белков кукурузы;
1,2 линия ВИР 40ТС
3-6 гибрид Краснодарский ПГ 201 ТВ;
7-10 смесь двух линий: ВИР 40ТС и С 103 ЗТ;
11, 12 линия С 103 ЗТ
На фиг. 2 изображено электрофоретическое разделение спирторастворимых белков сорго;
1, 2 Сумак карликовый А 278
3-6 гибрид Цунами 85;
7-10 смесь родительских форм: Сумак карликовый А-278 и Дн 69;
11, 12 Дн 69
Ниже приводится расчет гибридности для гибрида Краснодарский ПГ-201 ТВ.

Для этого сначала находят отношение содержания С₄₇ к D₅₃ у смеси родительских линий данного гибрида (ВИР 40 ТС и С 103-ЗТ) по всем имеющимся дорожкам:
1,50; 1,51; 1,64; 1,72; 2,10;
1,10; 1,50.

Затем полученные отношения суммируют и делят на число дорожек, равное 7. Среднее значение для смеси двух родительских линий равно 1,58. Аналогичные операции проводят для гибрида. Находят отношение содержания С₄₇ к D₅₃:
1,46; 1,46; 2,42; 1,59; 3,86;
2,32; 2,00.

Затем полученные отношения суммируют и делят на количество анализированных дорожек (7). Полученное число 2,16 используют в дальнейшем расчете. Для этого среднее отношение содержания реперного к характерному полипептидам смеси родительских линий (1,58) делят на среднее отношение содержания этих полипептидов гибрида (2,16), умножают на 100% и находят уровень (процент) гибридности
· 100% 73,2%
В общем виде все проведенные расчеты можно свести в одну формулу
× 100%
где Σ_р данные по смеси двух родительских форм;
Σ_г данные по анализируемому гибриду;
С_р относительное содержание реперного полипептида;
С_х относительное содержание характерного полипептида;
а количество проанализированных дорожек электрофореза. Данные по гибридности трех других гибридов, полученные по данному способу, представлены в таблице.

П р и м е р 2. Используют гибридные комбинации кукурузы (сложные гибриды). Из зерновок удаляют зародыши. Для анализа размалывают по 100 эндоспермов каждой родительской формы отдельно, 200 эндоспермов гибрида, а для получения смеси берут по 100 эндоспермов одной и другой родительской формы (в сумме 200 эндоспермов). Дальнейшая процедура по экстракции белков из муки и электрофорезу совпадает с описанной в примере 1. Реперными и характерными полипептидами для гибрида Алатау 107 ТВ являются В₄₀ и D₅₁; для гибрида Славутич 161 ТВ В₄₀ и А₃₁; для гибрида Южный 3 ТВ С₄₇ и А₃₁ соответственно. Дальнейший расчет уровня гибридности осуществляют по формуле, приведенной в примере 1. Данные по гибридности сложных гибридов кукурузы приведены в таблице.

П р и м е р 3. Используют гибридные комбинации сорго и сорго-суданковые гибриды. Для анализа размалывают по 100 зерновок каждой родительской формы отдельно, 200 зерновок гибрида, а для получения смеси берут по 100 зерен одной и другой родительской формы. Из каждого образца отвешивают в центрифужные пробирки по 600 мг муки. Для родительских форм в 2-3 пробирки, а для гибрида и смеси родительских линий 7-10 пробирок. В каждую пробирку приливают по 30 мл холодной дистиллированной воды, перемешивают и выдерживают при 4^оС в течение 30 мин. Центрифугируют при 8000 g в течение 15 мин, воду сливают, а осадок заливают 2 мл 70%-ного изопропанола, перемешивают и помещают в водяную баню на 1 ч при 60^оС. После центрифугирования при 8000 g в течение 15 мин надосадочную жидкость собирают и упаривают досуха под феном. Осадок растворяют в 50 мкл раствора того же состава, что и для кукурузы, и после прогревания полученной смеси на кипящей водяной бане в течение 5 мин раствор наносят на дорожку геля в объеме 20-25 мкл.

Электрофорез проводят так, как описано в примере 1. За реперный полипептид принимают наиболее мощный белковый компонент В₅₀ (авт. св. N 1604273). На фиг. 2 в качестве примера представлена фотография геля гибрида Цунами 85 и его родительских форм. Затем гели сканируют и определяют относительное содержание полипептидов, как описано в примере 1. Реперными и характерными полипептидами для гибрида Цунами 76 являются В₅₀ и А₃₄; для гибрида Цунами 85 и сорго-суданкового гибрида Алма-Атинский 81 В₅₀ и А₄₀; для сорго-суданкового гибрида Алма-Атинский 87 В₅₀ и D₆₈ соответственно. Уровень гибридности образцов находят по формуле, представленной в примере 1. Данные по уровню гибридности сорговых и сорго-суданковых гибридов приведены в таблице.

Использование предлагаемого способа определения гибридности семян злаковых по сравнению с существующим имеет следующие преимущества:
позволяет определять уровень гибридности семян сложных гибридов;
дает возможность оценивать уровень гибридности не только кукурузы, но также и других злаковых (сорговые и сорго-суданковые гибриды);
позволяет проводить оценку гибридности даже в том случае, если родительские формы недостаточно выровнены по полипептидному составу белков;
сокращает время анализа в 1,5-2 раза.

Использование: биохимия, селекционно-генетические исследования, сортовая идентификация. Сущность изобретения: уровень гибридности злаковых культур определяют путем анализа электрофоретических спектров гибридов и случайной смеси родительских форм и расчета по формуле, учитывающей относительное содержание разделившихся полипептидов. 2 ил., 1 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ГИБРИДНОСТИ СЕМЯН ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР, включающий извлечение из семян спирторастворимых белков, их электрофоретическое фракционирование, изучение полученных спектров и расчет уровня гибридности, отличающийся тем, что белки извлекают из семян гибрида и искусственной смеси его родительских форм, при изучении спектров определяют относительное содержание разделившихся полипептидов и уровень гибридности У рассчитывают по формуле

где Σ _p данные по смеси двух родительских форм;
Σ _г данные по анализируемому гибриду;
С_р относительное содержание реперного пептида;
С_х относительное содержание характерного пептида;
a количество изученных спектров (дорожек электрофореза).