Способ определения молекулярной массы белков Советский патент 1991 года по МПК C07K2/00 C07K1/14 

Изобретение относится к физико-химической биологии и биотехнологии, а именно к биологической химии, и может быть использовано научно-исследовательскими учреждениями при изучении свойств, структуры и функции белков.

Целью изобретения является упрощение анализа, снижение затрат и расширение возможности применения.

Способ состоит в том, что используют гетерогенный белок, который получают из эндосперма одноразовой кукурузы экстракцией раствором спиртовой мочевины. При этом экстракт включает набор полипептидов, которые после электрофореза с доде- цилсульфатом натрия (ДДС-Na) образуют характерный, легко идентифицируемый э ектрофоретический спектр компонентов с известными молекулярными массами, что позволяет использовать их в качестве стандартных белков-маркеров для определения молекулярной массы неизвестных белков.

П р и м е р 1. Зерна кукурузы освобождают от зародыша и размалывают до тонкого порошка, отвешивают 100 мг муки в пробирку, приливают 1 мл 70%-ного этанола с 2М мочевины, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 0,5 ч, а затем помещают на 1 ч на водяную баню при 60°С. После этого смесь центрифугируют при 7000 g в течение 15 мин, супернатант сливают, упаривают до 1/4-1/5 объема и используют в качестве набора полипептидов с известными молекулярными массами.

Для проведения электрофореза в поли- акриламидном геле (ПААГ) с ДДС-Na используют 5%-ный концентрирующий гель и 12,5%-ный разделяющий.

Перед электрофорезом белковый препарат смешивают с равным объемом буфера, содержащего 0,125 М трис-HCI (рН 6.8), 4% ДДС-Na, 20% глицерина, 0,002% бром- фенолового синего, и наносят на одну из дорожек ПААГ, на остальные наносят неизвестные белковые препараты.

О

о

сЈ

со ю

В данном случае используют глобулины из зерен пшеницы, кукурузы, сорго и риса. Электрофорез в пластинчатом геле (120 х 120) толщиной 1 мм ведут при постоянном напряжении 100 В до тех пор, пока бромфе- ноловый синий не достигает конца геля. По окончании электрофореза гель фиксируют в 10%-ном растворе трихлоруксусной кислоты в течение 1 ч, окрашивают 0,05-ным раствором красителя кумасси R-250 в течение 2 ч и отмывают от избытка красителя 10%- этанолом с 5%-ной уксусной кислотой. Полипептиды эндосперма кукурузы образуют весьма характерную картину независимо от образца кукурузы. При исследовании более 40 самоопыленных линий кукурузы возможно и в каждом случае легко идентифицировать маркерные полипептиды. Имеющиеся у кукурузы мобильные элементы кодируют совершен ю другие белки и никакого отношения к займовым белкам неммеют. Напротив, зеин кукурузы является крайне консервативным белком,

Для расчета молекулярной массы неизвестных- белков строят калибровочную кривую. По горизонтали откладывают расстояние от старта до конечного маркерного полипептида, а по вертикали логарифмы (Ln) молекулярных масс данных компонентов (см. чертеж). По данной кривой находят молекулярную массу неизвестных белков в интервале 17000-480000 Д, так как за пределами этих значений в эндосперме кукурузы просто нет белков.

Для определения молекулярной массы глобулинов измеряют расстояние от старта до всех неизвестных полипептидов глобулинов пшеницы, кукурузы, сорго и риса. Каждую цифру откладывают по оси абсцисс, проводят перпендикуляр до соединения с калибровочной кривой и от данной точки проводят перпендикуляр До оси ординат. По полученным цифрам находят в таблице мантисс десятичных логарифмов значения, которые соответствуют молекулярным массам неизвестных полипептидов. В таблице приведены молекулярные массы полипептидов глобулинов четырех названных культур, рассчитанных по предложенному способу.

П р и м е р 2. Зерно кукурузы освобождают от зародыша и размалывают до тонкого порошка, отвешивают 100 мг муки, в пробирку приливают 1 мл 65%-ного этанола

с 1,5 М мочевины, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 0,5 ч, а затем помещают на 1 ч на водяную баню при 60°С. Остальная процедура по проведению

электрофореза и определению молекулярной массы неизвестного белка совпадает с описанной в примере 1 Количество полипептидов зеина и их распределение по молекулярной массе совпадает с таковыми при

использовании экстракции с помощью 70%- ного этанола с 2М мочевины.

Пример 3. К 100мг тонко размолотого эндосперма кукурузы приливают 1 мл 75%- ного этанола, содержащего 2,5 М мочевины.

Остальная процедура по экстракции белка, электрофорезу и определению молекулярной массы неизвестного белка совпадает с описанной в примере 1. Количество полипептидов и их распределение по молекулярной массе одинаково зеиновым белкам, полученным с помощью 70%-ного этанола с 2 М мочевины.

Таким образом, для осуществления способа необходимо извлечь из эндосперма кукурузы зеин с помощью 65-75%-ного этанола, содержащем 1,5-2,5 М мочевины, и использовать их в качестве набора полипептидов с известными молекулярными массами.

Предлагаемый способ определения молекулярной массы неизвестных белков имеет следующие преимущества: использование маркерных полипептидов из эндосперма кукурузы упрощает и снижает затраты, позволяет легко и быстро без дополнительной очистки получить требуемый набор полипептидов в любом количестве в лабораторных условиях и определять молекулярную массу в широком диапазоне 17000-480000 Д.

Формула изобретения

Способ определения молекулярной массы белков, включающий сравнение исследуемого белка с набором маркерных полипептидов с известной молекулярной массой,отл ича ю щи йсятем, что, с целью упрощения анализа, снижения затрат и расширения возможностей применения, в качестве набора маркерных полипептидов используют зеиновый спектр кукурузы, полученный в результате электрофоретическо- го разделения белков, экстрагируемых 65-75%-ным этанолом с 1,5-2,5М мочевины

при нагревании.

Молекулярные массы полипептидов (КД) глобулинов зерна пшеницы, кукурузы, сорго и риса, вычисленные по распределению в ПААГ полипептидов спирторастворимого белка

кукурузы

Изобретение относится к физико-химической биологии и биотехнологии и позволяет быстро и экономично в лабораторных условиях получать смесь полипептидов для определения молекулярной массы белков. Целью изобретения является упрощение анализа, снижение затрат и расширение возможности применения. Для определения молекулярной массы белка используют гетерогенный белок из эндосперма кукурузы, экстрагируемый 65 - 75% этанолом с 1,5 - 2,5 М мочевины при нагреве. При этом в полученном препарате содержится специфичный набор компонентов, легко идентифицируемых в полиакриламидном геле после электрофореза, с помощью которого определяют молекулярную массу неизвестных белков в диапазоне 17000 - 480000 Д. 1 ил. 1 табл.

6.6

58

I

с:

«о

М

Ю 20 30 40 50 60 Расстояние от старта, мм

70 80