Способ получения автолизата дрожжей-сахаромицетов Советский патент 1990 года по МПК C12N1/06 A23J1/18 C12N1/06 C12R1/86 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам получения автолизата дрожжей, и может быть использовано в винодельческой промьшшенности при производстве игристых вин.

Цель изобретения - повышение качества автолизата.,

Способ заключается в том, что на первом этапе продолжительностью 6- 12 ч дрожжи-сахаромицеты вьщерживают в растворе экстрагента, в качестве которого применяют раствор хлористого калия или хлористого кальция, шш бикарбоната калия, или ЭДТА в концентрации 0,1-0,15 М, поддерживая рН 7,5-10,5 и температуру 20-50 с. Полученный автолизат, содержащий продукты гидролиза, под воздействием протеиназы I (пептиды и аминокислоты) отделяют от дрожжей, а последние помещают в другой экстрагент - буферный раствор (например, ацетатный, универсальный и др.), обеспечивающий условия активного действия протеиназы II. На втором этапе проО5

о

Од СП

ю

00

должительностью 6-12 ч дрожжи вьщер- живают в буферном растворе при рН 4,5-6,5 и температуре 42-60 С. Полученный автолизат отделяют от дрожжей одним из известных способов, например центрифугированием, и объединяют с автолизатом, полученным на певом этапе, а затем смесь очищают от низкомолекулярных веществ одним из известных способбв, например диа- лизом. Наиболее эффективной является вьщержка дрожжей на первом этапе автолиза при , рН 9,0 и температу- , а на втором этапе - при рК 5. и температуре 50-55 С. Полученный в результате применения предлагаемого способа автолизат характеризуется высоким содержанием азота, разнообразием его форм, а также ценными биологическими свойствами, обеспечи- вающими стабилизацию вин против коллоидных помутнений.

Сравнительная характеристика авто лизатов по концентрации азотистых 1 веществ и протеолитической активности приведена в табл.1.

Пептиды и белки являются поверхг. ностно-активными веществами, которые играют решающую роль в формировании пенистых свойств игристых вин, поэтому при разработке предлагаемого способа стремились получить автолизат с повьшенным содержанием пептидного и белкового азота.

Кроме того, что протеолитические фермец,ты целесообразно использовать в виноделии для стабилизации вин против коллоидных помутнений.

В автолизате, полученном по предлагаемому способу, протеолитические ферменты (протеиназы I и II) сохраняются в активной форме, благодаря чему при введении такого автолизата в шампанизируемое кюве не только повышаются пенистые свойства шампанского, но и достигается стабилизация его против коллоидных помутнений за счет использования активности собственных ферментов дрожжей,

П р и мер 1 (по известному спо .собу). Дрожжи осажденные расы Феодосия 1-19 вида Saccharomyces cerevi- siae в количестве 100 г помещают в 500 см 10%-ного спиртового раствора с рН 5,0 и в течение 18 ч выдерживают при . Затем смесь центрифугируют. В отделенном от дрожжей автолизате определяют активность протео

5

0

5

0

5

0

5

0

5

литических ферментов по гидролизу азоказеина и концентрацию различных форм азота (опыт 1 табл.2)„ Затем проводят инактивацию ферментов термическим шоком при 15°С,. Измерения показывают, что протеолитическая активность в автолизате исчезает (опыт 2 табл.2)с

Пример 2 (предлагаемый способ при оптимальных режимах). Осажденные дрожжи расы Феодосия 1-19 Saccharomyces cerevisiae в количестве 100 г помещают в 250 см 0,1 М раствора бикарбоната калия, доводят рН смеси до 9,0 1 н. щелочью NaOH и в течение 12 ч вьщерживают в термостате при , после чего.дрожжи отделяют центрифугированием от полученного автолизата, помещают в 250 см 0,2 М ацетатного буфера с рН 5,0 и в течение 12 ч вьщерживают в термостате при 55 С. Затем смесь центрифугируют и отделенный от дрожжей автолизат объединяют с автолизатом, пот- лученным на первом этапе. Для отделения низкомолекулярных веществ (солей, кислот и т.До) проводят диализ смеси. В полученном автолизате концентрация азота составляет, мг/дм : общий 430; аминный 100; пептидный и белковый 201; активность про- теолитических ферментов составляет 10,2 ед/г (опыт 3 табл.2).

Пример Зр Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но в качестве источника азотистых веществ и протеолитических ферментов используют молодые винные дрожжи расы Феодосия 1-19, отделенные от бродящего виноградного сусла во время экспоненциальной фазы их роста, В полученном автолизате концентрация азота составляет, мг/дм : общий А32, аминньй 98; пептидный и белковый 205; активность протеолитических ферментов составляет 12,0 ед/г (опыт 4 табл,2).

Пример 4. Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но в качестве источника азотистых веществ в протеолитических ферментов используют осажденные винные дрожжи расы 47-К. В полученном автолизате концентрация азота составляет, мг/дм общий 435; аминньй 96; пептидньй и белкоый 212; протеолитическая активность составляет 10,5 ед/г (опыт 5 табл.2).

Пример 5с Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и и в примере 2, но в качестве экстрагирующего раствора на II этапе автолиза используют универсальный буфер с рН 5,0. В полученном автолизате концентрация азота составляет, мг/дм : общий 428; аминный 98; пептидньга и белковый 200; активность протеолити- ческих ферментов составляет 10,4 ед/г (опыт 6 табл.2).

Пример 6. Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением .тех же режимов, что и в примере 2, но на I этапе автолиза для улучшения проницаемости дрожжевых оболочек и экстракции продуктов гидролиза дрожжевого белка в раствор вводят различные реагенты, применяемые для этих целей в практике биохимии: 0,05-0,5 М КС1; 0,05- 0,5 М 0,05-0,5 М ЭДТА; 0,5- 0,5 М NaCl; 20%-шз1й ацетон; 20%-ный хлороформ; 20%-ный толуол; 20%-ный этиловьй спирт (опыты 3, 7-23 табло2). Лучшие результаты получены при ис- пользовании ЭДТА, солей хлорида калия хлорида кальция, бикарбоната калия в концентрациях не менее 0,1 М. В полученных автолизатах концентрация азота составляет, мг/дм : общий 380- 430; аминный 46-100; пептидный и белкрБьш 156-212; протеолитическая активность составляет 8,2-12,0 ед/г (опыты 3, 7-13 табл.2). В вариантах предусматривающих использование указанных экстрагентов в меньших концентрациях (опыты 20-23 табл.2) и других реагентов (опыты 14-19 табл.2), получены автолизаты с недостаточной концентрацией азотистых веществ и незначительной протеолитической активностью. Так, концентрация общего азота в них составляет 10-230 мг/дм ,: аминного азота 0-40 мг/дм, пептидно- го. и белкового азота 0-100 мг/дм ; протеолитическая активность составляет 0-4,5 ед/го

Пример 7. Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но варьируют продолжительностью вьщержки на обоих этапах приготовления автолизата (опыты 24-29 табл.2). Снижение времени выдержки

до 6 ч приводит к снижению качества автолизата на 40-47%, которое выра- . жается в концентрации общего азота 234-287 мг/дм ; аминного азота 47- 50 мг/дм, пептидного и белкового азота 92-96 мг/дм и активности про- теолитических ферментов 5,2-5,4 ед/г (опыты 24-26 табло 2). Дальнейшее сни- Q жение вьщержки приводит к потере качества автолизата на 50% и более и выражается в концентрации общего азота 162-212 мг/дм , аминного азота 32-44 мг/дм, пептидного и белкового 5 азота 68-77 мг/дм и активности про- теолитических ферментов 3,0-4,8 ед/г (опыты 27-29 табл.2).Пример 8. Способ осуществляют в той же последовательности и с 20 соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но варьируют величиной рН на первом этапе автолиза. Для этого доводят экстрагирующий раствор до рН 7,0; 7,5; 9,0; 10,5; 11,0 (опыты 25 3, 30-34 табл.2)о Результаты показывают, что автолизаты, приготовленные при рН 7,5-10,5, на первом этапе содержат концентрацию общего азота 212-430 мг/дм, аминного азота 65- 30 100 мг/дм, пептидного и белкового азота 150-201 мг/дм, а активность протеолитических ферментов составляет 5,0-10,2 ед/г (опыты 3, 31-32. табл.2). Дальнейший сдвиг рН в щелочную или кислотную зону приводит к

эс

снижению концентрации азотистых веществ и протеолитической активности более, чем на, 50% от величины этих показателей при оптимальном рН 9,0

дд (опыты 30,33 таблс2).

Пример 9. Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но варьируют величиной

45 рН на втором этапе автолиза. Для этого доводят экстрагирующий раствор до рН 4,0; 4,5; 5,0; 6,5; 7,0 (опыты 3, 34-37 табл.2). Результаты пока- зьтают, что автолизаты, приготовлен50 ные при рН 4,5-6,5 на втором этапе, содержат концентрацию общего азота 198-430 мг/дм, аминного азота 52 - 100 мг/дм, пептидного и белкового азота 158-201 мг/дм, а активность

55 протеолитических ферментов 5,5- 10,2 ед/г (опыты 3, 35-36 табл.2). Дальнейший сдвиг рН в щелочную или кислотную зону приводит к снижению протеолитической активности и концентрации азотистых веществ более, чем на 50% от величины этих показателей при оптимальном рН 5,0 (опыты 34, 37 табл.2).

П р и.м е р 10. Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но варьируют температурой на первом этапе автолиза, Для этого температуру-доводят до 18, 20, 37, 50 и 52 с (опыты 3, 38-41 табл.2).

15

20

35

Результаты показывают, что автолиза- ты, приготовленные при температурах 20-50 0 на первом этапе автолиза, С сдержат концентрацию общего азота 182-430 мг/дм, аминного азота 60- 100 мг/дм , пептидного и белкового азота 104-201 мг/дм, активность протеолитических ферментов 6,0- 10,2 ед/г (опыты 3, 39-40 табло2). Автолиз при температуре ниже , и выше снижает протеолитичес- кую активность и концентрацию азотистых веществ в автолизате более, 25 чем на 50% от величины этих показателей при оптимальной температуре 37 С (опыты 38, 41 табЛо2).

Пример По Способ осуществляют в той же последовательности 0 и с соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но варьирует температурой на втором этапе автолизат. Для этого температуру доводят до 40, 42, 55, 60 и (опыты 3, 42-45 табл.2) Результаты показывают, что автолиза- ты, приготовленные при 20-50 С на втором этапе автолиза, содержат концентрацию общего азота 200-430 мг/дм аминного азота 54-10-0 мг/дм, пептид- д ного и белкового азота .98-201 мг/дм, а активность протеолитических ферментов 5,4-10,2 ед/г (опыты 3, 43-44 табл.2). Автолиз при температуре ниже 4;2 С и выше снижает протеоли- 5 ткческую активность и концентрацию азотистых веществ в автолизате более, чем на 50% от величины этих показате- .лей при оптимальной температуре (опыты 42, 45 табЛо2). .сп

Характеристика автолизата дрожжей в зависимости от режима автолиза приведена в табЛо2. .

Из данных табло2 следует, что на осуществление предлагаемого способа раса дрожжей-сахаромицетов и их физиологическое состояние не оказывают сугчественного влияния. Снижение времени автолиза до 6 ч на каждом i

6065288

в отдельности или на обоих вместе этапах ведет к незначительной потере концентрации азотистых веществ и протеолитической активности (теряется 10-45% .по сравнению с вариантами с вьщержкой 12ч), а дальнейшее снижение времени автолиза ведет к потере 50%, что снижает ценность полученных автолизатово Выбор режимов (температура, рН) проведен из соображений экономической целесообразности, которая заключается в следующем: внесение в игристое вино автолизата с концентрацией пептидного и белкового азота не менее 80 мг/дм обеспечивает повышение его пенистых свойств

.10

не менее, чем в

1,5

раза, применение

же автолизата, с меньшей концентрацией пептидного и белкового азота для достижения таких же пенистых свойств потребует недопустимого раз- бавления вина о Из применяемых на первом этапе автолиза реагентов лучшими являются хлористый калий, хлористый кальций, бикарбонат калия и ЭДТА в концентрации 0,1-0,15 Мо Для .создания рН на втором этапе автолиза природа применяемого буфера не имеет значения

Таким образом, преимущество предлагаемого способа по сравнению с извест- . ным заключается в повьппении активности протеолитических ферментов дрожжей в 2-2,5 раза за счет оптимизации условий их действия и, как следствие, повышение качества ав-толизата з.а счет обеспечения перевода в автолизат максимального количества азота, представленного значительно большим, чем в известном, разнообразиемо Так, концентрация общего азота увеличивается в 2-2,5 раз а, а пептидного и белкового азота - в 20-22 раза. Кроме того, исключение термической обработки автолизата позволяет сохранить его биоло- ги 1ески ценные свойства, заключающиеся в сохранении активности гидролитических ферментов дрожжей, которые воздействуя на биополимеры вин, обеспечивают их стабильность

Формула изобретения

Способ автолизата дрожжей-сахаромицетов , предусматривающий выдерживание дрожжей в растворе экст- рагента и отделение автолизата от дрожжей, отличающийся тем

не менее, чем в

1,5

раза, применение

0

5

5

0 д 5 п

же автолизата, с меньшей концентрацией пептидного и белкового азота для достижения таких же пенистых свойств потребует недопустимого раз- бавления вина о Из применяемых на первом этапе автолиза реагентов лучшими являются хлористый калий, хлористый кальций, бикарбонат калия и ЭДТА в концентрации 0,1-0,15 Мо Для .создания рН на втором этапе автолиза природа применяемого буфера не имеет значения

Таким образом, преимущество предлагаемого способа по сравнению с извест- . ным заключается в повьппении активности протеолитических ферментов дрожжей в 2-2,5 раза за счет оптимизации условий их действия и, как следствие, повышение качества ав-толизата з.а счет обеспечения перевода в автолизат максимального количества азота, представленного значительно большим, чем в известном, разнообразиемо Так, концентрация общего азота увеличивается в 2-2,5 раз а, а пептидного и белкового азота - в 20-22 раза. Кроме того, исключение термической обработки автолизата позволяет сохранить его биоло- ги 1ески ценные свойства, заключающиеся в сохранении активности гидролитических ферментов дрожжей, которые воздействуя на биополимеры вин, обеспечивают их стабильность

Формула изобретения

Способ автолизата дрожжей-сахаромицетов , предусматривающий выдерживание дрожжей в растворе экст- рагента и отделение автолизата от дрожжей, отличающийся тем

у 1

что, с целью повышения качества авто ЛИЗата, выдерживание дрожжей осущест вляют в два этапа, продолжительность 6-12 ч каждый, при этом на первом 3Taite в качестве экстрагента используют раствор хлористого калия или хлористого кальция, или бикарбоната калия, или этилендиаминтетрауксус606528 °

ной кислоты в концентрации 0,10-0,15 М при рН 7,5-10,5 и температуре 20-50 с, а на втором - буферный раствор при рН 4,5-6,5 и тей- пературе 42-60°С, а после отделения от дрожжей оба автолизата объединяют и очищают от низкомолекулярных

веществ Таблица 1

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве игристых вин. Цель изобретения - повышение качества автолизата. Способ заключается в том, что процесс автолиза ведут в два этапа : на первом этапе дрожжи выдерживают в течение 6-12 ч в растворе хлористого калия или хлористого кальция или бикарбоната калия, или этилендиаминтетрауксусной кислоты концентрацией 0,1-0,15 М при PH 7,5-10,5 и температуре 20-50°С

на втором этапе дрожжи выдерживают также 6-12 ч в буферном растворе при PH 4,5-6,5 и температуре 42-60°С. После отделения оба автолизата объединяют и очищают от низкомолекулярных веществ. За счет оптимальных условий действия протеолитических ферментов концентрация общего азота в автолизате увеличивается в 2,0-2,5 раза, а концентрация белкового и пептидного азота - в 20-22 раза. В автолизате сохраняется активность гидролитических ферментов дрожжей, которые воздействуя на биополимеры вин, обеспечивают их стабилизацию. 2 табл.

Тжвлид.

II

1606528

12

Продолжение таил. 2