СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО БЕЛКОВОГО ГИДРОЛИЗАТА И ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 A23J3/04 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологической промышленности, изготовлению питательных сред для культивирования бифидобактерий.

Современные принципы лечебной коррекции дисбиотических сдвигов и восстановления эубиоза основаны в первую очередь на предложенном почти столетие назад И. И. Мечниковым методе энтерального введения живых культур полезных бактерий. В настоящее время широкое распространение получило конструирование препаратов-пробиотиков, содержащих в качестве активного начала живых представителей нормальной микрофлоры человека.

Важнейшими задачами, направленными на оздоровление населения, являются исследования в области разработки новых эффективных препаратов-пробиотиков, усовершенствование выпускаемых форм, интенсификация и повышение экономической эффективности производства и гарантированном получении качественной продукции. Все возрастающая потребность населения в препаратах-пробиотиках и пищевых добавках обусловливает необходимость изыскания новых путей создания доступных способов получения биомасс кислотообразующих бактерий [1].

Филогенетически обусловлено, что бифидобактерии, являющиеся облигатными анаэробами, в естественных условиях преимущественно живут в условиях толстого кишечника, при которых белковый компонент их питания значительно гидролизован пищеварительными ферментами макроорганизма. При культивировании бифидобактерий основными субстратами питательных сред, лимитирующими рост и влияющими на физиологическую активность бактериальной популяции, являются источники азота и углерода. Требовательность данных бактерий к источникам питания, многим из которых для наиболее активного роста необходимы в готовом виде все аминокислоты, обуславливает необходимость разработки методов получения основ питательных сред, удовлетворяющих все потребности микроорганизмов в питательных веществах и обеспечивающих высокую концентрацию жизнеспособных бактерий в биомассе. Помимо этого, изучение потребностей бифидобактерий показало, что для оптимального роста им необходимы дополнительные ростовые факторы (витамины, пуриновые и пиримидиновые основания, аминосахара и др.), которые должны быть представлены в готовом виде, так как бифидобактерии неспособны синтезировать все компоненты, входящие в состав клеточного вещества [2, 3].

Поэтому применяемые в настоящее время питательные среды для накопления биомассы бифидобактерий характеризуются разнообразием своего состава. В производстве питательных сред используются субстраты и вещества, совершенно различные по своей природе. Культивирование бифидобактерий осуществляется на средах, основой которых являются гидролизаты и экстракты растительного и животного происхождения.

С учетом того, что основным назначением производственных питательных сред является обеспечение выпуска биопрепаратов, то к ним предъявляются еще ряд дополнительных требований: среды должны быть высококачественными, экономичными и относительно простыми в изготовлении [4].

Для культивирования бифидобактерий наиболее распространенной считается среда Блаурокка [2], которая содержит, г/л:

Пептон - 10,0

D(-) - лактоза - 10,0

Натрий хлористый - 5,0

L-цистин солянокислый - 0,1

Агар микробиологический - 0,75

Печеночный отвар - до 1 л

рН среды 6,8-7,0

Печеночно-цистеиновая среда для культивирования бифидобактерий считается оптимальной, однако эта среда содержит дорогостоящие компоненты и биологическое сырье (пептон ферментативный, L-цистин солянокислый, печень говяжья), поэтому для получения биомассы в промышленных условиях представляется экономически нецелесообразной.

Гидролизатно - молочная (ГМ) среда (5) имеет следующий состав, г/л:

Пептон - 2,0

Натрий хлористый - 2,0-3,0

L-цистин солянокислый - 0,1-0,15

D(-) - лактоза - 10,0

Агар микробиологический - 2,5

Гидролизат обрата молока - до 1 л

рН среды 7,2-7,4

ГМ - среда содержит в качестве питательной основы только гидролизованное молоко с конечной концентрацией аминного азота 70-110 мг % и недостаточно богата ингредиентами, стимулирующими рост бифидобактерий. Гидролизованное молоко не может в полной мере обеспечить потребности в источниках азотистого питания, витаминах и ростовых факторах, так как молоко не является естественной средой обитания бифидобактерий. Учитывая, что бифидобактерии не обладают казеолитической активностью, при приготовлении среды используют основу в виде гидролизованного молока, полученную с использованием дорогостоящего биологического сырья и компонентов (молоко коровье обезжиренное, панкреатин ферментативный).

Известна питательная среда для культивирования бифидобактерий “Бактофет” (6), включающая в состав, г/л:

D(-) - лактоза - 10,0

Натрий хлористый - 5,0

Агар микробиологический - 0,75

Ферментативный гидролизат мышечной ткани плодов коров 6-8 - месячного возраста, и/или свиней 2,5-3 - месячного возраста, и/или овец последних сроков суягности с конечной концентрацией аминного азота 100-140 мг % - до 1 л

рН среды 7,1±0,1

Основным достоинством среды “Бактофет” является исключение из состава среды дорогостоящего компонента L-цистина солянокислого, однако использование в качестве биологического сырья абортированных плодов коров, свиней и овец представляется небезопасным с эпидемиологической точки зрения, а забой животных на таких сроках беременности экономически нерентабелен.

Питательная среда для культивирования бифидобактерий на основе ферментативного гидролизата молозивной казеиново-сывороточной массы [7] содержит, г/л:

Железо сернокислое - 0,002-0,1

Натрий хлористый 4,0-6,0

Глюкоза 8,0-12,0

Агар микробиологический - 0,75-1,0

Аскорбиновая кислота - 0,8-1,0

Ферментативный гидролизат молозивной казеиново-сывороточной

массы - до 1 л

При культивировании бифидобактерий в питательной среде не обеспечивается достаточная скорость роста, так как содержание аминного азота в питательной среде (70-110 мг %) недостаточно для получения биомассы с высоким содержанием жизнеспособных клеток. Учитывая, что молозиво является дорогостоящим сезонным сырьем, данная среда трудновоспроизводима в промышленных условиях.

Известна питательная среды для культивирования бифидобактерий на основе кислотно-щелочного гидролизата бобовых (8), г/л:

Кислотно-щелочной гидролизат - 120-150 мг %

Пептон - 8,0-15,0

D(-) - лактоза 3,0-12,0

Агар микробиологический 0,7-0,9

Натрий хлористый 6,0-8,0

Вода - до 1 л

рН среды 7,0-7,1

Кислотно-щелочной гидролизат растительного сырья (гороха, люпина, люцерны) не может обеспечить в полной мере потребности бифидобактерий во всех необходимых источниках питания, что сказывается на ростовых свойствах питательной среды (согласно данным литературы, на средах с использованием гидролизатов растительного сырья хороший рост дают грибковые культуры [4]). Вследствие недостаточного количества свободных аминокислот снижается интенсивность роста микроорганизмов, что сказывается на количестве жизнеспособных бактерий в биомассе. Культура морфологически неоднородна, в пробирках отмечается нечеткая картина роста, эти признаки в дальнейшем могут привести к утрате ценных производственных свойств.

Ближайшим аналогом к заявляемой среде является казеиново-дрожжевая среда - КД-5 [9], содержащая в качестве основы панкреатический гидролизат казеина и дрожжевой автолизат:

Натрий хлористый - 5,0 г/л

Лактоза - 10,0 г/л

L - цистин солянокислый - 0,1 г/л

Агар микробиологический - 0,75 г/л

Дрожжевой автолизат - 650 мл/л

Панкреатический гидролизат казеина с конечной концентрацией аминного азота (150±10) мг % - 350 мл/л

Основу казеиново - дрожжевой среды составляют полуфабрикаты, приготовленные согласно известным технологиям:

1) панкреатический гидролизат казеина получают перевариванием коллоидной взвеси казеина ферментами фарша поджелудочной железы при рН 8,2-8,3 и температуре 37°С в течение 10 сут до достижения конечной концентрации аминного азота 500-600 мг % (10);

2) дрожжевой автолизат получают автолизом прессованных хлебопекарных дрожжей при температуре 53-56°С в течение 2-3 сут. Затем разводят водой из соотношения 3 л на 1 кг дрожжей и стерилизуют при температуре 120°С в течение 30 мин. Конечная концентрация аминного азота дрожжевого автолизата 200-250 мг % [4];

Казеиново-дрожжевая среда широко используется в производстве бифидумбактерина сухого. Двухкомпонентность источников азотистого питания определяет ростовые свойства питательной среды и обеспечивает получение биомассы бифидобактерий в концентрации 10⁷-10⁸ КОЕ/мл с последующим надежным сохранением жизнеспособных микробных клеток в процессе лиофильного высушивания.

Вместе с тем, помимо положительных качеств, казеиново-дрожжевая среда не лишена и недостатков. Питательная среда достаточно сложна в изготовлении вследствие длительности приготовления панкреатического гидролизата казеина и дрожжевого автолизата, требует большого расхода биологического сырья (дрожжей, поджелудочной железы) и дорогостоящих компонентов (казеина, L - цистина солянокислого).

Из-за высокой требовательности бифидобактерий к источникам азотного, углеродного, витаминного и минерального питания, обеспечивающим в полной мере потребности микроорганизмов и влияющим на физиологическую активность бактериальной популяции, урожай биомассы в казеиново-дрожжевой среде не достигает максимальных значений. Помимо этого, казеиново-дрожжевая среда используется только в последней стадии получения биомассы бифидобактерий и используется в качестве базового субстрата среды суспендирования. Получение маточной культуры бифидобактерий со всеми предшествующими пересевами осуществляют в дорогостоящей печеночно-цистеиновой среде (среде Блаурокка).

При этом при посеве маточной культуры, полученной в среде Блаурокка, в казеиново-дрожжевую среду наблюдается удлинение лаг-фазы и снижение удельной скорости роста (μ) в экспоненциальной фазе (определение проводят по кривой роста растущей культуры). Эти параметры свидетельствует о неоптимальности условий для наращивания биомассы в связи с тем, что микроорганизмы испытывают стресс при пересеве в экспоненциальной фазе роста в другую среду и им необходимо время для физиологической адаптации. Помимо этого, пересевы культуры со среды Блаурокка в казеиново-дрожжевую среду увеличивают риск изменения производственных свойств и способствуют возникновению спонтанных мутантов, которые влияют на однородность бактериальной популяции.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка питательной среды для выращивания бифидобактерий, обладающей высокой ростстимулирующей активностью и обеспечивающей концентрацию жизнеспособных клеток не менее 10⁹ КОЕ/мл на всех этапах получения биомассы бифидобактерий.

Технический результат заключается в получении новой экономичной питательной среды для культивирования бифидобактерий, в основу которой входят панкреатические гидролизаты казеина и мясного фарша-отжима, полученные по модифицированной методике и наиболее полно удовлетворяющие потребностям бактериальной популяции.

Сущность изобретения заключается в том, что питательная среда для культивирования бифидобактерий содержит в своем составе в качестве основы панкреатические гидролизаты казеина и мясного фарша-отжима с содержанием аминного азота 700-900 мг %, полученные по модифицированной методике. Питательная среда для культивирования бифидобактерий содержит:

Натрий хлористый - 4,0-5,0 г

L - цистин солянокислый - 0,10-0,15 г

Агар микробиологический - 0,75-1,00 г

Дрожжевой автолизат - 300-400 мл

Панкреатический гидролизат казеина с содержанием аминного азота 700-900 мг %, разведенный водой очищенной до содержания аминного азота 140-160 мг % - 300-350 мл

Панкреатический гидролизат мясного фарша-отжима с содержанием аминного азота 700-900 мг %, разведенный водой, очищенной до содержания аминного азота 140-160 мг % - 300-350 мл

Лактозы 40%-ный раствор - 25 мл (вносится асептически перед началом культивирования)

Готовая питательная среда должна быть стерильной и содержать аминного азота (150±10) мг %, рН 7,3±0,2.

В отличие от прототипа, питательная среда содержит панкреатический гидролизат мясного фарша-отжима (прежде утилизируемого после приготовления мясного настоя) с содержанием аминного азота 700-900 мг % и панкреатический гидролизат казеина с содержанием аминного азота 700-900 мг %, полученные по модифицированной методике. В питательной среде изменено соотношение компонентов основы: содержание дрожжевого автолизата с концентрацией аминного азота 200-250 мг % после оптимизации технологических параметров (уменьшение количества субстрата, изменение длительности автолиза, изменение температурного режима) составляет 30%, увеличение концентрации аминного азота в гидролизатах казеина и мясного фарша-отжима до 900 мг % также позволяет сократить расход полуфабрикатов.

Асептическое введение лактозы в состав питательной среды в виде 40% раствора перед культивированием позволяет получить среду с лучшими физическими свойствами и высокой ростстимулирующей активностью.

Совокупность отличительных признаков позволило получить следующие преимущества.

Приготовление сред из нескольких видов сырья способствует получению в питательной среде наиболее оптимального и сбалансированного состава для обеспечения сложных потребностей бифидобактерий, так как позволяет избежать пересыщения среды одними соединениями при недостатке других. Введение в состав питательной среды дополнительно панкреатического гидролизата мясного фарша-отжима способствует более полному удовлетворению микроорганизмов в источниках азотистого питания и ростовых факторов, так как казеин является белком молока, самой природой предназначенного для выполнения алиментарной функции, но по биологической ценности он уступает белкам мяса. Белки говядины отличаются лучшей аминограммой и более высокой биологической ценностью за счет аминокислотного состава (цистин, аланин, аспарагиновая и глютаминовая кислоты, серин, пролин и др.).

Введение в качестве дополнительного субстрата протеолиза и стимулятора ферментативных реакций отходов печени говяжьей позволяет оптимизировать процессы гидролиза казеина и мясного фарша-отжима при изменении фермент-субстратного соотношения и подобранных условиях гидролиза. Печень крупного рогатого скота является источником высокоценных белков, гликогена, лецитина, железа, большого количества ростовых факторов (никотиновой, пимелиновой, пантотеновой, фолиевой кислот, биотина и др.), в связи с этим в ферментативные гидролизаты добавляют отходы печени говяжьей, содержащие крупные печеночные протоки и утилизируемые прежде при приготовлении печеночных отваров и экстрактов.

При тщательном соблюдении условий гидролиза (температура - 45°С, рН 7,9-8,0) процесс ферментолиза казеина или мясного фарша-отжима завершается в течение 24-48 ч, что позволяет сократить продолжительность гидролиза в 3-5 раз. Использование заявляемой методики приготовления панкреатического гидролизата при оптимальном фермент-субстратном соотношении позволяет получить гидролизат с высокой степенью и глубиной расщепления белка, состав которого представляет главным образом смесь аминокислот (аминный азот 700-900 мг %) и низкомолекулярных пептидов, а использование отходов производства в виде мясного фарша-отжима и отходов печени говяжьей способствует значительному удешевлению производства питательной среды с последующим получением препарата более высокого качества (табл.1).

В качестве источника витаминов и дополнительного источника азотистого питания используют дрожжевой автолизат. В отличие от белков мяса, в хлебопекарных дрожжах содержание белков несколько ниже, но богаче содержание углеводов, витаминов и минеральных веществ. Основным источником углеродного питания при культивировании бифидобактерий является дисахарид лактоза (молочный сахар). В питательной среде, содержащей углеводы и подвергнутой воздействию высоких температур, происходят процессы карамелизации, гумификации, меланоидинообразования, что приводит к убыли исходного количества сахара и появлению темно-окрашенных продуктов распада углеводов, оказывающих ингибирующее на рост микроорганизмов действие. Асептическое введение лактозы в состав питательной среды в виде 40% раствора перед культивированием позволяет получить питательную среду с лучшими физическими свойствами и высокой ростстимулирующей активностью.

Исследование динамики роста бактериальной популяции позволяет использовать заявляемую среду для накопления биомассы при получении маточной культуры, что в свою очередь способствует оптимизации процесса культивирования бифидобактерий. Засев маточной культуры, полученной в заявляемой среде, обеспечивает начало роста бифидобактерий с минимальной задержкой, а лимитация роста раствором лактозы позволяет нарастить биомассу с максимальным выходом, достигнутым к стационарной фазе. Накопление биомассы в питательной среде в условиях периодического культивирования позволяет получить биомассу с высокой физиологической активностью (не менее 10⁹ КОЕ/мл) (табл. 2).

При морфологической проверке бифидобактерии, выращенные на предлагаемой среде, соответствуют предъявляемым требованиям: в мазках представляют собой неподвижные грамположительные раздвоенные палочки Y- или V-формы от 0,5-1,3×1,5-8 мкм, которые располагаются парами, иногда цепочками, не образуют спор и капсул.

Серии бифидумбактерина сухого, полученные культивированием в заявляемой питательной среде, обладают хорошей жизнеспособностью и антагонистической активностью (табл.3).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Приготовление панкреатического гидролизата казеина. 6 кг казеина предварительно растворяют в 30 л подогретой до 45°С очищенной воды, производят коррекцию рН до 8,8-9,0 введением в состав смеси безводного углекислого натрия. При периодическом перемешивании казеин набухает в течение 3-5 ч.

В реактор наливают 70 л подогретой до 45°С очищенной воды и загружают через люк коллоидную взвесь казеина. В гидролизуемой смеси устанавливают рН 7,8-8,0, добавляют 7 кг фарша поджелудочной железы и 2-4 кг отходов печени крупного рогатого скота или свиней, предварительно очищенных от жира и пленок и измельченных мясорубкой.

Гидролиз казеина длится до 2 суток при постоянной температуре 45°С и рН 7,8-8,0 до достижения конечной концентрации аминного азота 700-900 мг %. Полученный гидролизат в количестве 100 л фильтруют через миткалевое полотно в варочный котел. Затем в гидролизате устанавливают рН 4,5-4,7 добавлением 2,5 н. раствора соляной кислоты. После кипячения, осветления и фильтрации вводят хлороформ (5 мл/л) и хранят при температуре (5±3)°С в течение 3-х месяцев.

Пример 2. Приготовление панкреатического гидролизата мясного фарша-отжима

В качестве сырья используют фарш-отжим, полученный после приготовления мясной воды. В реактор наливают 100 л очищенной воды, при постоянном перемешивании загружают через люк 40,0 кг мясного фарша-отжима. В гидролизуемой смеси устанавливают рН 7,8-8,0, добавляют 7 кг фарша поджелудочной железы и 2-4 кг отходов печени крупного рогатого скота или свиней, предварительно очищенных от жира и пленок и измельченных мясорубкой.

Гидролиз длится до 2 суток при постоянной температуре 45°С и рН 7,8-8,0 до достижения конечной концентрации аминного азота 700-900 мг %. Полученный гидролизат в количестве 100 л фильтруют через миткалевое полотно в варочный котел. Затем в гидролизате устанавливают рН 4,5-4,7 добавлением 2,5 н. раствора соляной кислоты. После кипячения, осветления и фильтрации вводят хлороформ (5 мл/л) и хранят при температуре (5±3)°С в течение 3-х месяцев.

Пример 3. Питательная среда для культивирования бифидобактерий.

300 мл предварительно профильтрованного через ватно-марлевый фильтр дрожжевого автолизата соединяют с 350 мл панкреатического гидролизата казеина, разведенного водой очищенной до содержания аминного азота 140-160 мг %, и 350 мл гидролизата мясного фарша-отжима, разведенного водой очищенной до содержания аминного азота 140-160 мг %. В питательную среду вносят 5 г натрия хлористого и тщательно перемешивают. рН смеси подводят 20% раствором натрия гидроокиси до значения (7,5±0,1), затем тщательно перемешивают, нагревают до 100°С, кипятят на слабом огне в течение 15 мин и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа. После фильтрации через миткалевый фильтр полученную смесь нагревают до 80°С, вносят 0,75 г агара микробиологического и кипятят при помешивании в течение 5 мин до полного расплавления агара. Добавляют 100 мг L - цистина солянокислого и тщательно перемешивают. Измеряют полученный объем и при необходимости доводят очищенной водой до (1000±10) мл.

Стерилизуют в стерилизаторе паровом при температуре (110±1)°С и давлении 0,05 МПа в течение 30 мин.

Готовая питательная среда должна быть стерильной и содержать аминного азота (150±10) мг %, рН 7,3±0,2.

Перед использованием в питательную среду вносят расчетное количество 40% раствора лактозы, предварительно подвергнутого дробной стерилизации текучим паром.

Литература

1. Н.А.Тихомирова. Технология продуктов лечебно-профилактического питания, М., 2001, с.180-182.

2. П.П.Степаненко. Микробиология молока и молочных продуктов. М., 1999, с.167-176.

3. Патент РФ 2169763, С 12 N 1/20, опубл. 27.06. 2001 г. Молочная питательная среда для получения жидкого концентрата бифидобактерий.

4. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней, под ред. проф. Н.Н.Жукова-Вережникова, М., 1962 г., т.1, с.339-342, с.355.

5. ГОСТ 25102-82 или СанПИН 42-123-49-40-88 п.5.2 и 7.2.

6. Патент РФ 2002801, С 12 N 1/20, опубл. 1993 г. Питательная среда “Бактофет” для культивирования бифидобактерий.

7. Патент РФ 2080376, С 12 N 1/20, опубл. 27.05.97 г. Питательная среда для культивирования бифидобактерий.

8. Патент РФ 94026139, С 12 N 1/20, опубл. 10.05.96 г. Питательная среда для культивирования бифидобактерий.

9. Регламент производства №625 Бифидумбактерин сухой от 16.12. 1996 г., с.150-151.

10. В.Н.Кикалишвили. Технология питательных сред в производстве бактерийных препаратов, Тбилиси, 1963, с.78-80.

11. Патент РФ 2027754, МПК С 12 N 1/20, опубл. 27.01.95 г. Питательная среда для выращивания микроорганизмов и способ получения панкреатического гидролизата казеина.

12. Патент РФ 2080376, МПК С 12 N 1/20, опубл. 27.05.97 г. Питательная среда для культивирования бифидобактерий.

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологической промышленности, изготовлению питательных сред для культивирования бифидобактерий. Питательная среда для культивирования бифидобактерий содержит в своем составе в качестве основы панкреатические гидролизаты казеина или мясного фарша – отжима с содержанием аминного азота 700-900 мг %. В состав гидролизуемой смеси дополнительно введены отходы печени говяжьей или свиной в количестве 20-40 г/л. Питательная среда также содержит дрожжевой автолизат, натрий хлористый, агар микробиологический, L – цистин солянокислый, лактозу при следующем содержании исходных компонентов: натрий хлористый - 4,0-5,0 г, L - цистин солянокислый - 0,10-0,15 г, агар микробиологический - 0,75-1,00 г, дрожжевой автолизат - 300,0-400,0 мл, панкреатический гидролизат казеина с содержанием аминного азота 700-900 мг %, разведенный водой, очищенной до содержания аминного азота 140-160 мг % - 300,0-350,0 мл, панкреатический гидролизат мясного фарша-отжима с содержанием аминного азота 700-900 мг %, разведенный водой, очищенной до содержания аминного азота 140-160 мг % - 300,0-350,0 мл, лактозы 40%-ный раствор - 25,0 мл. Изобретение позволяет получить новую питательную среду, наиболее полно удовлетворяющую потребностям бактериальной популяции. 2 с.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения панкреатического белкового гидролизата, включающий гидролиз казеина или мясного фарша-отжима ферментами фарша поджелудочной железы крупного рогатого скота с последующей очисткой, отличающийся тем, что в состав гидролизуемой смеси дополнительно вводят отходы печени говяжьей или свиной в количестве 20-40 г/л и гидролиз ведут до достижения концентрации аминного азота 700-900 мг%.2. Питательная среда для культивирования бифидобактерий, содержащая панкреатический гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, натрий хлористый, агар микробиологический, L-цистин солянокислый, лактозу, отличающаяся тем, что дополнительно содержит панкреатический гидролизат мясного фарша-отжима при следующем содержании исходных компонентов:

Натрий хлористый 4,0-5,0 г

L-цистин солянокислый 0,10-0,15 г

Агар микробиологический 0,75-1,00 г

Дрожжевой автолизат 300,0-400,0 мл

Панкреатический гидролизат казеина с содержанием аминного азота 700-900 мг%,

разведенный водой очищенной до содержания аминного азота 140-160 мг% 300,0-350,0 мл

Панкреатический гидролизат мясного фарша-отжима с содержанием аминного азота 700-900 мг%, разведенный водой очищенной до содержания аминного азота 140-160 мг%

300,0-350,0 мл

Лактоза, 40%-ный раствор 25,0 мл