Способ моделирования снижения активности альдегиддегидрогеназы печени Советский патент 1991 года по МПК G09B23/28 

(21)4624245/14 (22)21.12.88 (46)15.04.91. Бюл. № 14

(71)Институт биохимии АН БССР и Гродненский государственный медицинский институт

(72)В. И. Сатановская и Ю. И Бандажевский (53)615.475(0888)

(56) Drug metabol. Pes 1979, vol,9, № 2, p 319-335.

(54) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ СНИЖЕНИЯ АКТИВНОСТИ АЛЬДЕГИДДЕГИДРО- ГЕНАЗЫ ПЕЧЕНИ

(57) Изобретение относится к экспериментальной медицине и быть применено при моделировании врожденной ферменто- патии Цель изобретения - повышение воспроизводимости врожденной патологии Для этого самкам на 11-16-й дни беременности однократно внутримышечно вводят пирогензл в дозе 500-625 МПД/кг массы тела способ воспроизводим у всего потомства

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования врожденной сниженной активности альдегиддегидроге- назы (АльДГ) печени крыс с целью изучения механизмов аверсивной реакции и факторов риска сопутствующих алкоголизму заболеваний.

Целью изобретения является повышение производительности врожденной патологии.

Способ осуществляется следующим образом.

После спаривания животных производят исследование влаюлища В мазках определяют наличие сперматозоидов, в случае обнаружения которых у самки констатируют 1-й день беременности При моделировании врожденного снижения активности АльДГ в печени у потомства животных самкам крыс на 11-16-й дни беременности вводят однократно внутримышечно пирогенал в дозе 500-625 МПД/кг массы тела. На всем протяжении эксперимента беременных самок содержат в изолированных клетках на обычном рационе вивария Родившихся крысят

оставляют с самками до 30-дневного возраста, после чего крысят отсаживают от матери и вскармливают до половозрелости на рационе вивария В возрасте 80-90 дней крыс умерщвляют декапитацией Печень замораживают и хранят в жидком азоте до начала анализа. Определение активности АльДГ печени проводят спектрофотометри- чески по методу Тоттмара с соавторами Оп- ределяют общую альдегидокислящую способность печени в присутствии 5 мМ ацетальдегида, которая отражает суммарную активность всех изоформ АльДГ (мито- хондриальную, эндоплазматическую и цитозольную с высокой и низкой константой Михаэлиса (Км) к альдегидам) Активность, внутримитохондриального фермента с низкой Км определяют в присутствии 50 мкМ концентрации субстрата Активность фермента выражают в нмоль НАДН образовавшегося за 1 мин на 1 мг белка (м U) Достоверность различий между группами оценивают по Т-критерию Стьюдента

В предлагаемом способе моделирования дефекта АльДГ печени крыс на этапе отработки оптимальных его параметров бы(Л

Ю

ел о

VJ

ло установлено, что наилучший эффект от использования предлагаемого способа регистрировался при введении самкам животных пирогенала на 11-16-й дни беременности в дозе 500-625 МПД/кг массы тела. Введение пирогенала самкам животных в более ранние сроки их беременности (до 11 дней), когда происходит закладка основных органов, может вызвать появление у потомства врожденных уродств и преждевременную гибель, а в более поздние сроки (свыше 16 дней) - преждевременные роды, оканчивающиеся, как правило, гибелью плода. Доза пирогенала выбрана с учетом того, что введение препарата самкам животных в дозе ниже 500 МПД/кг массы тела не обеспечивает достижения эффекта на снижение активности фермента в печени у потомства животных, а в дозе выше 625 МПД/кг массы тела вызывает патологические изменения в морфологии и биохимической картине крови, что ведет к увеличению уродств и смертности потомства в пре- и постнатальном периоде. Сроки забора образцов печени для анализа (80- 90-й день после рождения) обоснованы тем, что, начиная с 60-го дня жизни крысы становятся половозрелыми и активность АльДГ к этому периоду достигает максимального значения.

Пример 1. Самке крысы массой 200 г на 11-й день беременности вводили внутримышечно однократно пирогенал в дозе 500 МПД/кг массы тела. С первого дня беременности, подтвержденной наличием сперматозоидов во влагалищном мазке, животных содержали в отдельной клетке на обычном рационе вивария. Роды закончились рождением 7 детенышей. Гибели крысят как в день родов, так и в течение месяца постна- тальной жизни не наблюдалось. Спустя месяц после рождения крысят отсадили от матери и вскармливали до половой зрелости на рационе вивария. В возрасте 80 дней из опытной и контрольной групп родившихся крысят (14 шт.) выборочно отобрали самку и самца. Отобранных крыс (4шт.) забили и произвели забор печени. Печень заморозили и хранили в жидком азоте до начала анализа. Анализ проводили при 23°С. При этом использовали имкубацион- .ную смесь следующего состава: натрий-пи- рофосфатный буфер 50 мМ, рН 8,8, НАД 0,5 мМ; амитал натрия 1 мМ, пиразол 1 мМ. Конечный объем пробы 2 мл. Реакция начиналась добавлением субстрата: 5 мМ и 50 мкМ ацетальдегида. Изменение экстинкции регистрировали спектрофотометрически при 340 нМ, активность фермента расчитывали в нмоль НАДН, образовавшегося за 1

мин на 1 мг белка (м U). Концентрацию белка определяли по методу Лоури. Активность фермента, определенная при 5 мМ ацетальдегида, отражает суммарную активность

АльДГ с высокой и низкой Км к альдегидам, а при 50 мкМ - только с низкой Км к альдегидам - ферменту с основной ролью в метаболизме ацетальдегида.

Результаты анализа печени опытных и

0 контрольных животных.

Общая активность АльДГ печени у самки и самца (опытная группа) составила соответственно 9,9 и 7,1 м U, а активность фермента печени с низкой Км у этих же жи5 вотных соответственно 0,9 и 0,7 м U.

Общая активность АльДГ печени у самки и самца контрольной группы составила соответственно 7,1 и 7,6 м U; активность фермента печени с низкой Км v этих же

0 животных - соответственно 2,1 и 1,0 м11.

Пример 2. Самке крысы массой 210 мг на 13-й день беременности вводили внутримышечно однократно пирогенал в дозе 580 МПД/кг массы, а контрольной - изотониче5 ский раствор хлорида натрия. С первого дня беременности, подтвержденной наличием сперматозоидов во влагалищном мазке, животных содержали в отдельной клетке на обычном рационе вивария. Роды закончи0 лись рождением 5 крысят. Гибели крысят как в день родов, так и в течение месяца постнатальной жизни не наблюдалось. Спустя месяц после рождения крысят отсадили от матери и вскармливали до половой зре5 лости на рационе вивария. В возрасте 85 дней из опытной и контрольной групп выбо- оочно отобрали одну самку и одного самца. Отобранных крыс (4шт.) забили и произвели забор печени. Печень заморозили и хра0 нили в жидком азоте до начала анализа. Определение активности АльДГ печени осуществляли по методу Тоттмара, как описано в примере 1.

Результаты анализа печени опытных и

5 контрольных животных.

Общая активность АльДГ печени у самки и самца опытной группы составила соответственно 7,1 и 5,8 м U; активность фермента АльДГ печени с низкой Км у самки

0 не обнаружена, а у самца составила 0,5 м U. Общая активность АльДГ печени у самки и самца контрольной группы составила соответственно 16,0 и 13,0 м U; активность фермента АльДГ печени с низкой Км у этих

5 же животных соответственно 5,2 и 3,6 м U. Пример 3. Самке крысы массой 220 г на 16-й день беременности ввели внутримышечно однократно лирогенал в дозе 625 МПД/кг массы, а контрольной - изотонический раствор хлорида натрия. С первого дня

беременности, подтвержденной наличием сперматозоидом во влагалищном мазке, животных содержали в отдельной клетке на обычном рационе вивария. Роды закончились рождением 8 крысят, Гибели крысят как в день родов, так и в течение месяца постнатальной жизни не наблюдалось. Спустя месяц после рождения крысят отсадили от матери и вскармливали до половой зрелости на рационе вивария. В возрасте 90 дней из опытной и контрольной групп родившихся крыс (14 шт.) выборочно отобрали одну самку и одного самца. Отобранных крыс (4 шт.) забили и произвели забор печени. Печень заморозили и хранили в жидком азоте до начала анализа. Определение активности АльДГ печени осуществляли по методу Тоттмара, как описано в примере 1. Результаты анализа печени опытных и контрольных животных.

Общая активность АльДГ печени у самки и самца опытной группы составила соответственно 6,8 и 5,6 м U; активность

фермента АльДГ печени с низкой Км этих же животных не обнаружена.

Общая активность АльДГ печени у самки и самца контрольной группы составила соответственно 11,5 и 9,3 м U; активность фермента АльДГ печени с низкой Км у этих же животных соответственно 2,8 и 2,9 м U.

Таким образом, введение самкам крыс на 11-16-й дни беременности пирогенала в дозе 500-625 МПД/кг массы тела обеспечивает врожденное снижение активности АльДГ в печени у потомства животных.

Формула изобретения Способ моделирования снижения активности альдегиддегидрогеназы печени путем введения лекарственных веществ экспериментальному животному, отличающийся тем, что, с целью обеспечения врожденного снижения активности альдегиддегидрогеназы печени, самкам на 11- 16-й дни беременности однократно внутримышечно вводят пирогенал в дозе 500-625 МПД кг массы тела.