Способ моделирования энцефалопатии у потомства при воздействии нетоксичных доз марганца в пренатальный период Российский патент 2023 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине, биологии, токсикологии, и касается способа моделирования энцефалопатии у потомства при воздействии нетоксичных доз марганца в пренатальный период.

Несмотря на то, что в течение последних нескольких десятилетий на территории Российской Федерации были приняты меры контроля уровня поллютантов, во многих субъектах РФ было зарегистрировано превышение предельно допустимых концентраций ряда металлов, включая и марганец, в атмосферном воздухе, в почвах, на водозаборах питьевого и хозяйственно-бытового назначения [Черногаева Г.М. Обзор состояния и загрязнения окружающей среды в Российской Федерации за 2019 год / Г.М. Черногаева, Л.Р. Журавлева, Ю.А. Малеванов, Ю.В. Пешков, М.Г. Котлякова, Т.А. Красильникова // Федеральная служба по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды (Росгидромет). - 2020. - 217 с.]. Помимо этого, среди населения непрерывно растет потребление биологически активных добавок эссенциальных микроэлементов, бесконтрольный и длительный прием которых может увеличивать нагрузку на организм и приводить к неблагоприятным последствиям, связанным, главным образом с риском их передозировки, особенно в период беременности. Добавки с микроэлементами часто рекомендуются во время беременности, однако их эффективность остается недостаточно изученной [Слободская Н.С. Биологически активные добавки: начение и применение / Н.С. Слободская // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. - 2015. - № 4. - С. 119-122.; Белоусова О.В. Биологически активные добавки как перспективное направление развития фармацевтического рынка / О.В. Белоусова, Е.А. Белоусов, А.О. Иващенкова // Научный результат. Медицина и фармация. 2016. - Т.4. - №4. - С. 89-94]. Подобные данные вызывают беспокойство о возможных последствиях, в частности, пренатального воздействия марганца на функциональное состояние потомства. Существует высокий риск возникновения у потомства дизадаптации, нарушений в когнитивных и поведенческих реакциях, регуляции физиологических функций.

В связи с этим, для изучения механизмов развития патологических процессов в ткани мозга у потомства необходима разработка новых способов моделирования энцефалопатии, наиболее приближенных к реальным клиническим условиям.

Патентный поиск свидетельствует об отсутствии способов моделирования энцефалопатии с использованием марганца. Наиболее близкими патентами моделирования энцефалопатии являются методы с использованием химических соединений.

Известен способ моделирования гипоксической энцефалопатии в пренатальный период у мелких лабораторных животных. Данный способ заключается в том, что беременным самкам крыс ежедневно подкожно вводят раствор нитрита натрия в дозе 50 мг/кг с 10-го по 19 день беременности. Это приводит к гипоксическому поражению головного мозга и способствует развитию энцефалопатии у взрослых животных, что подтверждается при оценке поведения, когнитивных способностей и морфологической структуры нервной ткани головного мозга [Способ моделирования гипоксической энцефалопатии в пренатальный период у мелких лабораторных животных / Л.М. Соседова, В.А. Вокина, В.С. Рукавишников // Номер патента: RU 2 497 202 C1, опубликовано: 2013.10.27].

Недостатком данного способа является выбор вводимой дозы препарата животным. Несмотря на то, что авторы использовали относительно малую дозировку нитрита натрия (50 мк/кг, что составляет примерно 1/4ЛД₅₀), при его многократном введении в течение 10 дней она превышает летальную дозу ЛД₅₀ более чем в 2,5 раза, что оказывает сильное токсическое воздействие на организм. В литературе встречаются данные, что развитие гипоксического состояния у грызунов можно вызвать при меньших дозах введения нитрита натрия.

Известен еще один способ моделирования гипоксической энцефалопатии, заключающийся в том, что лабораторным животным однократно внутрибрюшинно или внутривенно вводят фенилгидразин в дозе 100-150 мг/кг, что позволяет достоверно воспроизвести гипоксическую энцефалопатию [Способ моделирования гипоксической энцефалопатии / Г.Н. Зюзьков Н.И. Суслов, А.А. Федоров, Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай // Номер патента: RU 2 253 152 C2, опубликовано: 2005.05.27].

Недостатком данного способа является то, что в качестве вводимого препарата заведомо используют фенилгидразин, являющимся сильнейшим ядом и вызывающим в дозе 150 мг/кг в первую очередь острую интоксикацию у животных. Помимо этого, способ введения препарата имеет также важное значение, именно от него будет зависеть механизм развития патологии. В данном случае одним из способов введения был выбран внутрибрюшинный путь. При этом, не все препараты, предназначенные для внутривенного введения, пригодны для внутрибрюшинной инъекции, так как могут обладать местным раздражающим эффектом, вследствие чего может развиваться воспаления брюшины.

Ближайшим аналогом изобретения является способ моделирования отдаленной токсической энцефалопатии. Данный способ заключается в том, что лабораторным животным многократно вводят ртуть ингаляционным путем в виде ее паров со средней концентрацией 0,362 мг/м³ в течение 7 недель ежедневно по 4 часа пять раз в неделю. Полученная модель позволяет максимально приблизиться к клиническим особенностям, наблюдаемым у человека [Способ моделирования отдаленной токсической энцефалопатии / Соседова Л.М., Якимова Н.Л., Хамуев Г.Д., Титов Е.А., Рукавишников В.С. // Номер патента: RU 2 341 828 C1, опубликовано: 2008.12.20].

Значительным недостатком данной модели является, то что, моделирование токсического воздействия тяжелых металлов воспроизводится у половозрелых крыс с функционально полноценной нервной системой, а не в пренатальный период. Следует отметить, что во всех перечисленных способах моделирования применяется острое токсическое воздействие препаратов на организм, а, следовательно, механизм развития энцефалопатии у животных в данном случае будет отличаться от реальных патофизиологических процессов, происходящих в мозговой ткани человека.

Технической задачей предлагаемого изобретения является максимальное приближение модели к этиологии и клинике у человека за счет воздействия нетоксичных доз марганца. Данная модель даст возможность не только изучать механизмы развития энцефалопатии у потомства, но также апробировать в данной модели биологически активные добавки жизненно необходимых микроэлементов, дозы и сроки их назначения в период беременности. Известно, что рекомендации по применению биологически активных добавок к пище должны быть составлены на основе экспериментального изучения БАД и содержать сведения об их дозировке, курсе приема, прежде чем быть рекомендованы женщинам в период беременности.

Техническая задача достигается тем, что способ моделирования энцефалопатии у потомства осуществляется путем воздействия нетоксичных доз марганца в пренатальный период.

Способ реализован следующим образом.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментальных исследованиях в условиях экспериментально-биологической клиники ФНЦ БСТ РАН, г. Оренбург на крысах линии Wistar (n=80) в соответствии с протоколами Женевской конвенции и принципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009), а также согласно рекомендациям «The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Washington, D.C. 1996)».

Моделирование нарушений в работе центральной нервной системы потомства осуществляли путем перорального воздействия марганца на самок-крыс в предгестационный и гестационный периоды. Для этого самки до беременности в течение 4 недель получали основной рацион с добавлением соли пентагидрата сульфата марганца (MnSO₄*5H₂O) в дозе 1433 мг/кг/сут, что в пересчете на чистый металл (Mn) составляло 327 мг/кг/сут. Выбранная доза соответствовала 2/3LD₅₀. Далее к самкам подсаживали интактных самцов с целью получения потомства. Добавление MnSO₄*5H₂O в рацион самок продолжалось и в период гестации (3 недели). Животные контрольных групп находились на основном рационе.

Оценку состояния центральной нервной системы осуществляли у самцов из полученного потомства в возрасте 12-недель с использованием тестов «Открытое поле» и «Водный лабиринт Морриса». Проводился анализ сыворотки крови животных на уровень марганец-содержащих ферментов (аргиназа (ARGI) и супероксиддисмутаза (SOD2)) и нейроспецифических показателей (ацетилхолинэстераза (AChE) и белок S100B) с помощью иммуноферментного анализа. Обработку полученных данных проводили при помощи методов вариационной статистики с использованием статистического пакета «STATISTICA 10» (StatSoft Inc., США). Применялись непараметрические процедуры обработки статистических совокупностей (U-критерий Манна-Уитни).

Конкретные примеры выполнения способа

Пример 1. У полученного потомства, подвергшегося пренатальному воздействию марганца, в возрасте 12-недель при оценке результатов теста «Открытое поле» отмечалось увеличение двигательной активности, что характеризовалось значительным увеличением пройденного расстояния - Q₂₅ опыта статистически значимо больше Q₇₅ контроля на 86,2 % (p=0,03), а также увеличением скорости передвижения животных в арене - Q₂₅ опыта достоверно больше Q₇₅ контроля на 22,8 % (р=0,01). Частота груминга и количество фекальных болюсов также увеличилось - значение медиан по обоим показателям было выше контрольных значений на 100 %. Статистически достоверные изменения были отмечены в ориентировочно-исследовательской активности потомства - Q₂₅ опыта больше Q₇₅ контроля на 20 % (p=0,003) (таблица 1).

Таблица 1
Основные параметры, оцениваемые в тесте «Открытое поле» у животных первого поколения Показатели Контроль (потомство I) Опыт (потомство I) Общее расстояние (см) 1 127,5 (1 061,9-1 205,4) 2 647,7 (2 245,5-3 126,6) ^* Скорость (см/с) 4,42 (4,26-5,43) 7,34 (6,67-7,53) ^** Суммарный груминг 2,0 (0,5-4,0) 4,0 (3,0-5,0) Дефекация 2,0 (1,0-3,0) 4,0 (3,0-5,0) ^*** Обследование отверстий 4,0 (1,0-5,0) 8,0 (6,0-9,5) ^**

Примечание: полученные данные представлены в виде медианы (Ме) и 25-75-го центилей (Q₂₅-Q₇₅); значком * обозначена достоверная разница между опытной группы (потомство I) и контрольной группой (потомство I) (р≤0,05); значком ** (р≤0,01); значком *** (р≤0,001)

При рассмотрении паттернов передвижения животных опытной группы, подвергшейся пренатальному влиянию марганца, было установлено увеличение активности животных в центральной зоне поля, животные продемонстрировали более высокую тенденцию к исследованию площади всей арены (фиг. 1).

Пример 2. У полученного потомства, подвергшегося пренатальному воздействию марганца, в возрасте 12-недель при оценке результатов теста «Водный лабиринт Морриса» наблюдались достоверные отклонения от контрольных значений, начиная уже с первого дня обучения. Опытным особям требовалось гораздо больше времени, чтобы найти платформу - значение Q₂₅ опыта была достоверно больше Q₇₅ контроля на 32 % (р=0,05) в первый день тренировки; на 141 % (р=0,002) во второй день; на 136 % (р=0,007) в третий день и на 298 % (р=0,03) в четвертый день. В сравнение, животные контрольной группы быстро освоили задачу теста и в течение сессии обучающих испытаний улучшали свои навыки (фиг. 2).

Аналогичные изменения были характерны и для расстояния, которые проплыли животные опытной группы (потомство) (фиг. 3).

Пример 3. У полученного потомства, подвергшегося пренатальному воздействию марганца, при оценке результатов иммуноферментного анализа отмечалось, что концентрация ARGI была достоверно выше, чем в контроле; концентрация SODII не изменялась. Были зафиксированы статистически значимые отличия в содержании фермента AChE - уровень данного фермента был достоверно больше контрольных значений; отмечалась тенденция к повышению содержания белка S100B (фиг. 4).

Оценивая полученные результаты, можно заключить, что пренатальное воздействие нетоксичной дозы марганца приводило к нарушению функционирования нервной системы крыс, характеризующееся повышением тревожности, нарушением когнитивных реакций - нарушения в процессах рабочей и пространственной памяти, снижение способности к обучению; зафиксированы стойкие изменения в концентрации ферментов ARGI и AChE.

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине, биологии, токсикологии, и касается способа моделирования энцефалопатии у потомства при воздействии нетоксических доз марганца в пренатальный период. Для этого самкам крыс ежедневно в общий рацион добавляют марганец сернокислый пятиводный в дозе 1433 мг/кг/сут в прегестационный период 4 недели и период гестации 3 недели. Изобретение позволяет создать модель энцефалопатии у потомства, максимально приближенную к этиологии и клинике у человека. 4 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ моделирования энцефалопатии у потомства при воздействии нетоксичных доз марганца в пренатальный период, заключающийся в ежедневном пероральном воздействии марганца сернокислого пятиводного в дозе 1433 мг/кг/сут на самок крыс в прегестационный период 4 недели и период гестации 3 недели.