t
(21)4488071/13
(22)28.09.88
(46) 30.04.91. Бюл. У 16
(71)Институт микробиологии АН БССР
(72)Н.И.Мильто и Л.А.Сухопицкая
(53)63:576.8(088.8)
(56)Авторское свидетельство СССР 633897, кл. С 12 N 1/20, 1978.
(54)ШТДММ БАКТЕРИЙ BACILLUS MFGATE- RIUM ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, ЮЩЕГО ЛОСФОРНОЕ ПИТАНИЕ РАСТЕНИИ
(57)Изобретение относится к почвенной микробиологии, в частности к получению препарата,улучшающего фосфорное питание растений за счет использования труднорастворимых фосЛа- тов железа в почве, что способствует повылению урожая овощных культур, и представляет собой новый штамм дпя получения указанного выше препарата. Целью изобретения является получение нового птамма, обладающего более высокой способностью трансформации Fиз Фосфатов железа. Штамм бактерии Bacillus nep,acerium AP-1 выделен из кремнеземистого .апроппя и депонирован во Всесоюзной коппгкцпм промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный го- мер BKJTM R-4440. Основной особенностью штамма является то, что он обеспечивает (юлее высокий уровень фосфорного питания в наиболее шветст- венный, начальный период развития растений. Птамм на глкжозоаспарагмноО
вой среде дает титр 2,85x10 клетол при рН 4,2 и мобилизует ФосФчтов 44,6 мг/100 мп за 25 сут вырашмва- ния, а известные - 6,2-16,1 MI/100 мл. Птамм для получения препарат, улучшающего Фосфорное питание растении, повышает усвояемость фосфора, Ликси- рованного почвой, и повышает урожайность овощных культур. 6 табл.
С Ј
(Л
Изобретение относится к почвенной микробиологии, в частности к получению препарата, улучшающего фосфорное питание растений за счет использования труднорастворимых фосфатов железа в почве, что способствует повышению урожая овощных культур, и представляет собой новый штамм для получения вышеуказанного препарата.
Целью изобретения является получение нового штамма, обладающего более высокой способностью трансф.орма- ции из фосфатов железа.
Штамм бактерий Bacillus megacerium выделен из кремнеземистого сапропеля .
Выбор объекта выделения был обусловлен тем, что сапропели являются хорошим субстратом для развития многих групп микроорганизмов, среди которых могут быть и фосфатрастворя- ющие культуры; кроме того, кремнеземистые сапропели богаты фосфатами железа.
Штамм выделен на глкжозоаспара- гиновой среде с осажденным ЛосФатом железа. Идентифицирован в соответствии с руководствами Красильникоча и Берги, ему присвоен 1 АР-1.
Штамм бактерий Rac.megaterium АР-1 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов
сь
4Ь
сл
N5
О ОЭ
института ВШШгенетика, коллекцион- ный номер ВКГГМ-В-4440.
Штамм имеет спедующую характерно- тику.
Морфологические и культуральные признаки.
Цитология: грамположительные палочки 1,5-1,7x3-5 мкм, одиночные или попарно сцепленные, реже цепочки из 3-4 клеток (24-часовая культура на мясосусло-агаре): эксцентрально расположенная опора (четырехсуточ- няя культура на мясосусло-агаре).
Мясосусло-агар. Колонии на мясосусло-агаре на 2/3 сут. роста гладкие, бело-кремовые, выпуклые, жирнобле- стящие, края ровные, профиль выпуклый, консистенция маслянистая, диаметр колоний 3-8 мм. При выращивании на этой средр колонии штамма приобретают кремово-коричневый цвет на 8 - 10-е сутки, Рост по штриху на мясосусло-агаре ровньй, хороший. В жидкой среде (7-суточная культура в мясо- пептонном бульоне) образуется рыхлый осадок, после взбалтывания которого наблюдается равномерное помутнение среды.
МЯСОПРПТОННЫЙ агар. На 2-3-м сутки роста колонии гладкие, блестящие, белые, выпуклые. Края колоний ровные, профиль слегка выпуклый, консистенция вязко-маслянистая, диаметр колоний 3-6 мм. Равномерно эмульгируется в воде.
Глюкояоаспарагиновый агар. Состав среды, г/л: глюкоза 10; аспарагин 1,0; K4S04 MRS04 7НгО 0,2; агар-агар 20,0; вода водопроводная до 1,0 л. Колонии штамма на 4-5-е сутки роста округлые, размер 2-5 мм, блестящие, белого цвета, поверхность гладкая, профиль слегка выпуклый,края колонии ровные, консистенция тестообразная. Равномерно эмульгируется в воде. рН оптимум роста заявляемого штамма 6,60-6,75.
Физиологические и биохимические признаки.
Аэроб. Обладает каталазной активно стью. Использует углерод глюкозы, мальтозы, сахарозы, маннита, сорбита и рафинозы с образованием кислот. При использовании лактозы рН среды не меняется. Гидролизует крахмал. Разжижает желатину. Пентонизирует лакмусовое молоко. Развивается на мясопептонном бульоне в присутствии
0
5
0
5
0
5
0
5
5
2,5- и 6,5%-ного хлористого натрия. Не растет на безазотистой среде Эшби. Не образует ацетилметилкарбинола, сероводорода. Не восстанавливает нитраты.
R лабораторных условиях развивается в диапазоне температур 18-43°С. Оптимум 26-24°С.
Маркерные признаки штамма.
Проведены исследования и определены спектры естественной устойчивости штамма к некоторым антибиотикам по методу Bronfield.
Результаты исследований приведены в табл. 1 .
Условия хранения штамма.
Штамм хранится и поддерживается методом периодических пересевов (не реже 1 раза в полгода) на мясосусло- агаре. Последний состоит из смеси равных объемов мясопептонного бульона и 4-5в) сусла с 2% агар-агара.Среду стерилизуют при 3/4 ати 20 мин.
Признаки штамма устойчивы. Птамм непатогенен для теплокровных животных.
Пример 1. Использование штамма для получения препарата, улучшающего фосфорное питание растений.
Готовят посевной материал, для чего выращивают штамм на скошенном мясосусло-агаре в течение 24 ч.
Затем 1 мл водной суспензии микробной культуры засевают колбы с глюкозоаспарагиновой средой, содержащей осажденный фосфат железа.
Состав среды, г/л: глюкоза 10; аспарагин 1,0; KZS04 0,2; MgS04 x х 7НгО 0,2.
Перед стерилизаций , среду разливают по 100 мл в конические колбы объемом 250 мл. Стерилизация: 0,5атм, 20 мин. Для получения осажденного фосфата железа навески солей;3040мг Na,P04 2HjO и 2164 кг РеСЦ 6Н20. - растворяют в 25 мл стерильной дистиллированной воды, стерилизуют в фильтре Яейтца и после этого сливают в одну колбу. Образовавшийся высокодисперсный препарат фосфата железа вносят по 5 мл на 1СО мл стерильной глюкозоаспарагиновой среды.
Готовая глюкозоаспарагиновая среда содержит 496 мг фосфора в 1000 мл; рН 6,9.
Условия культивирования: глубинное выращивание Вас.negateriun AP-1 на качалке (220 об/мин) в течение 10-25 сут при 24-26°С.
51645266
Содержание в фугате культу- ральной жидкости определяют колориметрически с использованием молибдер4
новой сини и двухлористого олова в качестве восстановителя.
Исходный титр культуры, растворяющей фосфат железа 1,64«10 клеток/м
Количество фосфора, переведенного штаммом из фосфата железа, вычисляют по разности между его содержанием в опытном и контрольном (стерильном) вариантах.
Результаты исследований приведены в табл.2.
Данные табл.2 показывают возможность трансформации предлагаемы штаммом Вас.meparerium AP-1 и труд- норастворимых фосфатов железа, счон- ственных дерново-подзолистым почвам.
Проведены сравнительные исследования по растворению фосфатов железа в глюкозолспарагиновой среде различными микроорганизмами, выделенными и.з озерных сапропглей.
Полученные данные приведены в табл.3.
Как видно из табл.3, предлагаемый штамм по признакам утилизации фосфатов из труднорастворимых соединений железа превосходит другие известные микроорганизмы.
Примеры использования полученной глубинной культуры в вегетационных опытах на ряде овощных кулыур.
Пример 2. Возможность улучшения фосфорного питания растений и повышения урожая путем исно н-зования фосфатрастворяющен культуры Вас.mega ceriun АР-1 проверяют в вегетационном опыте на ряде овощных культур, так как известно, что фосфорно питание овощных ускоряет развитие растений, образование органов плодоношения, сокраг1ает период созревания.
Предпосевную бактеризацию семян редиса сорта Ультра и моркови сорта Нантская проводят непосредстг нно во время посева их в биометр. Агрохимическая характеристика почвы биометра: 7,0b; содержание азота: общего 0,08%, аммиачного 12,6 и нитратно;о 7,1 мг/кг; а.с.в. 17,0 кг/100 г почвы. v;(o6pe- ния в почву не вносят. Нагрузка микробной культуры составила для редиса Ю , для моркови 1-10 кле гок/се- мя. Содержание фосфатов железя в образдах почвы 14,6 мг/100 г, или 43,3% от суммы минеральных фосфатов. Данные по урожаю редиса и моркови
0
5
0
5
0
0
в вегетационном опыте с предлагаемым штаммом Вас.negateriun AP-1 приведены в табл.4.
Как показывают данные табл.4, бактеризация обеспечивает доступность PjOj- для растений (моркови и редиса) и повышает урожайность этих культур.
Пример 3. Семена огурцов сортов белорусские и Монастырские перед посевом замачивают в суспензии клеток Вас. me acerium AP-1 (смыв с косяка трехсуточной кутьту- рьО и затем высевают в . Почва биометра имеет с 1ед Т1щу7« химическую характеристик : pHkcg 5,3S; содержание азота: общего 0,16, аммиачного 15.О м нитратного 8,3 мг/кг; л. г. в. Р о,. 1 (:, Q мг/ /100 г почвы. Удобропп в почву биометра не вносят. Содержание фосфатов железа в образцах почв 16,0 мг/100 г, что составляет 46,6% от суммы мичеральш-гх фосфатов.
Данные о влиянии прс посевтто замачивания семян огурцов r rvcnen- зии Вас .megacerium AP-1 на в вегетационном опыте приведены в табл.5).
Данные табл.5 показывают увети- чение урожайности огурцов при Г, чк- теризации семян на 13-21%.
Пример 4. R произволе грент)ых условиях определено влияние предпосевной обработки семян кормовой свеклы сорта Эккендорфска i культурой Вас .I legacerium ДР-1 . Почва торфяно-болотная. Агрохимические показатели опытного участка: рНkcg 5,47; содержание азота: общего 2,0%, 5 аммиачного 30 и нитратного 334 мг/ /1000 гга.с.в. Р2Г)5 11,0 мг/ЮО г почвы. Содержание труднораствори- мых фосфатов железа в пробах почвы 21,7 мг/100 г,что составляет 57,8% от суммы минеральных фосфатов.
Результаты производственных испытаний приведены в табл.6.
Таким образом, использование штлм- ма Bacillus megaterium AP-1 по сравнению с известными дает слгтующпе преимущества: возможное i ь. трансфор- мации труднорасл воримнх фосфатов железа, свойственных дерново-подзолистым почвам; возможность растворять FePO в течение продолжительного времени, что позволяет поднять временную границу растворения этого соединения биологическим путем и обеспечения доступности РаО овощным культурам в ранние стадии онтогенеза.
Бактериальный препарат на основе штамма бактерий Bac.negateriun AP-1 улучшает фосфорное питание растений, попытает усвояемость фосфора, фиксированного почвой, и повышает
урожайность овощных культур:
t
Формула изобретени
Штамм бактерий Bacillus roegate- riun ВКПИ В-4440 для получения препарата, улучшающего фосфорное пита- ние растений.
13,7±2,27 21,813,18 44,6+2,12
Таблица 1
Естественная устойчивость штамма Bacillus negaterium AP-1 к антибиотикам
Антибиотики
Устойчивость штамма при концентрации антибиотика, Х/мл
Стрептомицин
сульфат114,8
Ампициллин, натриевая соль5,9 Полимиксин R сульфат 283,3 Тетрациклин хлорид Высокая чувствительность при концентрации до
20
5,
Таблица 2
Редис сорта Ультра
Контроль Бактеризация,
Вас. nega- terium
92,2±1,Q6 2214 100 80,5tt,37 2174 100 15,9
86,5+1,73 2508 113 97,4±1,58 3800 121 17,5
Таблица 6
Вариант
Контроль Бактеризация Вас. negaterium
Редактор Л.Веселовская
Составитель С.Тюрин Техред Л.Сердюкова
1645266
10
Таблица 4
Прибавка
ц/га
п
440
774
334
+ 76
Корректор т.ПалиП
