Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, касается получения микробиологических средств повышения урожая растениеводческой продукции и представляет собой новый штамм для изготовления бактериального удобрения под свеклу.
Цель изобретения - создание нового штамма Pseudomonas radiobacter, позволяющего получить более высокий урожай свеклы.
Штамм выделен из органического озерного сапропеля. Выбор объекта выделения был обусловлен тем, что органические сап- ропели являются благоприятным субстратом для развития микроорганизмов многих физиологических групп, среди которых имеются как микроорганизмы-стимуляторы, так и фосфатрастворяющие культуры.
Штамм депонирован во всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Института ВНИИгенетика, коллекционный номер В-4466.
Штамм имеет следующую характеристику.
Морфологические и культуральные признаки. Мясопептонный агар. Поверхностное культивирование в чашках Петри в термостате при 27°С: колонии 48-часовой культуры гладкие, прозрачные, серовато- белые. Края колоний ровные, профиль выпуклый, консистенция вязкая. Диаметр колоний 2-3 мм.
Мясо-сусло-агар Условия культивирования те же. При выращивании на этой среде на 2 сут роста колонии круглые, гладкие, прозрачные, серб-белые. Края их ровные, профиль выпуклый, консистенция вязкая. Диаметр колоний 2-4 мм.
Глюкозо-аспарагиновая среда (состав среды, г/л: глюкоза 10; аспарагин 1,0; KaSO 0,2; MgS04-7H20 0.2; агар-агар 20,0; вода водопроводная до 1 я). Колонии штамма при культивировании в термостате при 27°С на 4 сут роста округлые, белые, консистенция слегка вязкая.
w
Ё
41 S3 U О 41 СО
Цитология: грамотрицательиые подвижные палочки размером 1,5-2,0 х хО,5 мкм, одиночное расположение (18-часовая культура в мясо-пептон ном бульоне).
Физиологические и биохимические признаки. Аэроб. Обладает каталазной активностью. Отношение к источнику углерода: использует глюкозу, мальтозу, сахарозу, маннит, лактозу, сорбит, рафинозу с обра- зованием кислот. Способ использования перечисленных углеводов - аэробное окисление.
Не гидролизует крахмал. Не разжижает желатину. Не образует сероводород, амми- ак. Образует ацетилметилкарбинол. Восста- навливает нитраты. Слабо пептонизирует молоко. Отношение к источнику азота: усваивает пептон, аспарагин, глицин, мочевину или аммоний сернокислый в количестве 0,01-0.02% от объема среды.
Растет на минеральной среде, содержащей, г/л: (NH4)2HPO4 3,0; КН2Р04 2,0; NaClO.5; MgS04 -7Н20 0,3; CaCIa -бНаО 0,1; 6Й20 0,01; смесь микроэлементов по Федорову 1 мл (она содержит, г/л дистиллированной воды: НзВОз 5; (NH4)2Mo04 5; KI 0,5; NaBrO,52; ZnSO4 -7H20 0,2; А12(504)з 0,3, рН среды 6,5.
Штамм развивается в интервале темпе- ратур 15-30°С. Оптимум - 26-27°С. Оптимум рН 6,0-7,0. Не развивается в присутствии 6,5%-ного хлористого натрия. В лабораторных условиях оптимум роста 24-26°С. Признаки штамма устойчивы. Не является антагонистом клубеньковых бактерий и азотобактера.
Способ условия и состав для поддержания и длительного хранения штамма.
В. radiobacter АР хранят и поддержива- ют методом периодических пересевов (1 раз в полгода) на мясопептонный или мясо-сусло-агар. Последний состоит из смеси равных объемов мясопептонного бульона и 4-5°С сусла с 2% агар-агара. Среду стери- лизуют при 0,75 атм 20 мин.
Пример 1. Способ получения бактериального препарата.
Для получения микробо-сапропелевого препарата используют две жидкие среды: мясо-сусло-пептонный бульон для получения расплодки Ps. radiobacter АР и жидкая сапропелевая среда, приготовленная на основе органического сапропеля из расчета 2,0% масса/объем по сухому веществу, для получения основной культуры и препарата согласно нижеприведенной схеме:
Схема получения микробо-сапропелевого препарата
Культура Ps. radiobacter на скошенном мя со-суслога га ре
Культивирование Ps. radiobacter на жидком мясо-сусло-бульоне на качалке в течение 2 сут (титр 1,40-109 клеток/мл - рас- плодка)|
Культивирование Ps. radiobacter на жидкой сапропелевой среде на качалке в течение 2 сут (титр 1,63 10 клеток/мл)
Доращивание Ps. radiobacter в стационарной культуре в течение 7 суток (титр 8,25 109 клеток/мл - препарат)
П р и м е р 2. Отбор стимуляторов из коллекции псевдомонад, выделенных из органического сапропеля, проводят в лабораторных условиях на семенах редиса сорта Ультра. Семена перед проращиванием обрабатывают бактериальными суспензиями проверяемых культур по следующей схеме: штаммы Pseudomonas spp, выращивают на скошенном мясо-сусло-агаре и течение 24 ч, затем готовят их суспензии (смыв с косяка 20 мл стерильной воды); семена замачивают в течение 6 ч в бактериальных суспензиях проверяемых культур; семена затем многократно отмывают дистиллированной водой; обработанные семена проращивают на увлажненных фильтрах в чашках Петри в течение 3 сут при 23°С.
Полученные результаты представлены в табл.1.
П р и м е р 3. Исследован синтез биологически активных соединений штамма Ps. radiobacter АР следующим образом.
Внеклеточные аминокислоты определяют на аминоанализаторе после культивирования штамма на среде, содержащей, г/л: NH4CI 3,0; глюкоза 50,0; К2НР040,5; КН2РО4 0,5; СаСОз 3,0; MgS04 0,5; рН 7.0. Среду разливают в конические колбы по 100 мл и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. Посевной материал - суспензия 48-часовой культуры Ps.radiobacter АР в стерильной водопроводной воде. Суспензию получают смывом клеток с поверхности скошенного мясопёп- тонного агара. Количество посевного материала 5 об.%. Культуру выращивают на качалке (220 об/мин) при 28°С в течение 5 сут. По окончании опыта культуру центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин. Нэдосадочную жид кость используют для идентификации и определения количества внеклеточных аминокислот.
Рибофлавин в КЖ Ps. radiobacter АР определяют флюорометрическим методом, основанным на способности рибофлавина флюоресцировать в ультрафиолетовом свете. Величину флюоресценции измеряют после 3-суточного выращивания культуры на среде следующего состава, г/л: глюкоза 10,0; лактоза 3,0; Na-лимоннокислый 3-за- мещенный 3,0; NH4CI 3,0; К2НР04 0,4; NaCI 3,0; вода дистиллированная до 1 л, рН 7,0. Среду разливают по 100 мл в конические колбы и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. Посевной материал - суспензия 48-часовой культуры Ps. radiobacter в стерильной водопроводной воде. Количество посевного материала 5 об.%. Культивирование на качалке при 220 об/мин, 28°С, в течение 3 сут. По окончании культивирования центрифугирование при 6000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость используют для определения рибофлавина.
Полученные результаты представлены в табл.2.
П р и м е р 4. Штамм Ps. radiobacter АР для подготовки посевного материала выращивают на скошенном мясо-сусло-агаре в течение 24 ч. Затем 1 мл водной суспензии микробной культуры засевают колбы с глю- козо-аспарагиновой средой, содержащей осажденные фосфаты железа и алюминия. Состав среды, г/л: глюкоза 10; аспарагин 1,0; K2SO4 0,2; MgS.CM /7H20 0,2. Перед стерилизацией среду разливают по 100 мл в конические колбы объемом 250 мл. Стерн- лизация: 0,5 атм, 20 мин. Для получения осаждённых фосфатов навески, содержащие 3040 мг ЫазР04 12Н20 и 2164 мг РеС1з-6Н20 (в случае получения фосфата железа) и 3040 мг МазРСм -12Н20 и 1932 мг А1С1з бНзО (для получения фосфата алюминия) растворяют в 25 мл стерильной дистиллированной воды, стерилизуют в фильтре Зейтца и после этого сливают в одну колбу. Образовавшиеся высокодисперсные препа- раты фосфатов вносят по 10 мл в 100 мл среды. Условия культивирования: глубинное выращиваниеРз. radiobacter АР на качалке (220 об/мин) в течение 25 сут при 24-26°С. Содержание P20s в фугате культу- ральной жидкости определяют колориметрически с использованием молибденовой сини и двухлористого олова в качестве восстановителя.
Результаты представлены в табл. 3.
П р и м е р 5. В производственных условиях определено влияние предпосевной обработки семян кормовой свеклы сорта Эккендорфская микробо-сапропелевой питательной смесью, приготовленной на ос- нове органического сапропеля и культуры Ps. radiobacter АР. Титр Ps. radiobacter АР в препарате составляет 8,25 + 0,42-Ю9 клеток/г а.с.в.
Результаты представлены в табл. 4 и 5.
Данные, приведенные в табл. 4 и 5, убедительно подтверждают более высокую эффективность использования бактериального препарата на основе штамма Ps. radiobacter АР под свеклу по сравнению со штаммом Bacillus megaterlutr.
П р и м е р 6. Возможность повышения урожая овощных культур путем использования штамма Ps. radiobacter АР проверяют в вегетационных опытах. Предпосевную бактеризацию семян редиса и моркови проводят непосредственно во время их посева в биометр. Агрохимическая характеристика почвы биометра: рНш 7,05. содержание азота: общего 0,08%, аммиачного 12,6 мг/кг, нитратного 7,1 мг/кг а.с.в., P20s 17,0 мг/100 г почвы. Нагрузка микробной культуры составила для морковиА-10 , для редиса Ю6 клеток/семя.
Семена огурцов сорта Монастырские перед посевом замачивают в бактериальной суспензии.культуры Ps. radiobacter АР и затем высевают в биометр. Почва биометра имела следующую агрохимическую характеристику: рНко 5,55,, содержание азота: общего 0,16%, аммиачного 15,0 мг/кг, нитратного 8,3 мг/кг а.с.в., P20s 16,9 мг/100 г почвы.
Результаты приведены в табл. 6.
Таким образом, использование штамма Ps. radiobacter АР по сравнению с известным штаммом дает следующие преимущества: возможность стимуляции всхожести и прорастания семян свеклы за счет образования более мощной корневой системы; возможность сочетания стимулирующего эффекта за счет продуцирования физиологически активных веществ и трансформации Р2Об из труднорастворимых фосфатов алюминия и железа, свойственных дерново- подзолистым почвам. Это позволяет стимулировать развитие растений, особенно свеклы в ранние стадии онтогенеза, а также растворять фосфаты полуторных окислов микробиологическим путем и таким образом обеспечивать доступность фосфора растениям; возможность создания бактериального препарата на основе штамма Ps. radiobacter, который в результате жизнедеятельности микробной культуры, стимулирует развитие и улучшает фосфорное питание растений, особенно свеклы, повышает усвояемость фосфора, фиксированного почвой, и приводит к увеличению урожая овощных культур и корнеплодов.
Формула изобретения
Штамм бактерий Pseudomonas radiobacter ВКПМ В-4466 для получения бактериального удобрения под свеклу.
Таблица 1
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, касается получения микробиологических средств повышения урожая растениеводческой продукции и представляет собой новый штамм для изготовления бактериального удобрения под свеклу. Целью изобретения является создание нового штамма Pseudomonas radiobacter, позволяющего получить более высокий урожай свеклы. Штамм бактерий Pseudomonas radiobacter выделен из озерного сапропеля/депонирован в ВКПМ под N В-4466. Штамм позволяет получить прибавку урожая кормовой свеклы на 5-41% больше и сахарной соеклы на 5% больше по сравнению с известным штаммом. 6 табл.
Сравнительная характеристика стимулирующего влияния Pseudomonas spp. на рост корешков редиса сорта Ультра в идентичных условиях
Замачивание семян в воде; Штамм Ps.radiobacter АР.
Т а б л и ц а 2 Синтез биологически активных соединений штаммом Ps. radiobacter АР
Мобилизация AtPCM и РеРСм штаммом Ps.radiobacter АР в глубинной
культуре (мг/100 мл)
Количество фосфора, переведенного штаммом из фосфатов железа и алюминия, вычисляют по разности между его содержанием в опытном и контрольном (стерильном) вариантах.
Таблица 3
Результаты производственных испытаний эффективности Ps.radlobacter АР и Bac.megaterlum AP-I на кормовой свекле, сорт Эккендорфская
Результаты проверки эффективности применения Bac.megaterlum AP-I и Ps.radiobacter АР на кормовой и сахарной свекле
Влияние предпосевной бактеризации семян культурной Ps.radlobacter АР на урожай редиса, моркови, огурцов в вегетационных опытах
Таблица 4
Таблица 5
Таблица б
| Штамм бактерий BacILLUS меGатеRIUм для получения препарата, улучшающего фосфорное питание растений | 1988 |
|
SU1645266A1 |
| Кипятильник для воды | 1921 |
|
SU5A1 |
