Способ определения концентрации этанола в биологическом материале и выдыхаемом воздухе Советский патент 1991 года по МПК G01N33/98 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам судеоно-медицинской экспертизы, диагностики предрасположенности к алкоголизму, и может быть использовано наркологической службой.

Цель изобретения - повышение чувствительности и точности определения этанола в биологическом материале и выдыхаемом воздухе.

Способ осуществляют следующим образом.

Биологический материал предварительно подвергают микроперегонке. В раствор, содержащий 0,1 М, рН 10, глицин/№ОН-бу- фер, водный раствор НАД (24 Mr/мл) и иоднитротетразолий фиолетовый, вносят перегнанную пробу и раствор алкогольде- гидрогеназы (активность фермента составляет около 24 ME) из семян пшеницы с

последующим фотометрированием при длине волны 510 нМ.

При определении этанола в выдыхаемом воздухе последний барботируют через раствор, содержащий 0,1 М глицин/NaOH- буфер, рН 10, алкогольдегидрогеназу из семян пшеницы, НАД. Затем вводят иоднитротетразолий фиолетовый. Реакцию останавливают через 10 мин 0,2 М соляной кислотой и производят фотометрирование при той же длине волны.

П р и м е р 1. Определение этанола в сы.юротке крови.

Предварительно путем микроперегонки отдепяют этанол от сыворотки. Для этого 3 мл сыворотки помещают в пенициллиновый флакон. Туда же помещают стеклянные или пластмассовые открытые капсулы, объемом 0,8-1 мл, так чтобы верхний слой капсулы был на 4-5 мл выше уровня сыворотки во

О

о о ел с

флаконе. В капсулы опускают наконечники охлаждающей системы. Нагревают флаконы на водяной бане при 80°С в течение 1 ч. Пары летучих жидкостей, включая этанол, конденсируются на охлаждающих наконечниках микроперегонки и стекают в капсулу, объем конденсата в капсуле достигает 0,3- 0,5 мл. При этом достигается отделение этанола от белков и многих других веществ сыворотки крови, а также его концентрирование. Измеряют точный объем собранного конденсата в капсуле. Подготовленная проба может храниться в закрытой капсуле несколько дней.

Строят калибровочную кривую. Для этого определяет зависимость начальной активности приготовленного перед измерением раствора алкогольдегидрогеназы от концентрации стандартных растворов этанола.

Раствор алкогольдегидрогеназы перед употреблением готовят растворением лио- филизированного препарата из расчета 20 мг на 1 мл бидистиллированной воды (активность фермента составляет около 24 ME).

Активность фермента определяют следующим образом.

В спектрофотометрическую кювету вносят 1,1 мл М, рН 10, глицин/№ОН-буферно- го раствора, 0,1 мл 36 мМ водного раствора НАД (24 мг/мл), 0,1 мл иоднитротетразоли- евого фиолетового с исходной концентрацией 3,8 мг/мл и 0,2 мл раствора этанола с известной концентрацией от 0,75 до 75 мМ. Реакцию инициируют введением 0,2 мл раствора алкогольдегидрогеназы. Измерение оптической плотности фиксируют при длине волны 510 нм на спектрофотометре или фо- тоэлектрокалориметре.

Для определения содержания этанола в сыворотке крови определяют активность ал-, коголыидрогеназы аналогично описанному, но вместо раствора этанола с известной концентрацией вводят в кювету 0,2 мл стю- на из капсулы. По калибровочной кривой находят концентрацию этанола в кювете. Затем рассчитывают концентрацию этанола в сыворотке крови по формуле

(ЭТАНОЛ)сыворотки С А/В,

(D

где А - коэффициент разведения отгона в кювете;

С - концентрация этанола, определенная по калибровочному графику;

В - коэффициент концентрирования при отгоне этанола из сыворотки равный отношению объема взятой сыворотке к объему отгона в капсуле.

П р и м е р 2. Определение этанола в выдыхаемом воздухе.

Для определения этанола в выдыхаемом воздухе последний медленно барботируют через раствор, содержащий 2 мл 0,1 М глицин/МаОН-буфер рН 10, в котором растворены 1 мг алкогольдегидрогеназы и 2 мг НАД. Объем барботируемого воздуха равен 1 литру (можно брать 2 или 3 л). Затем вводят

0,05 мл 5,4 мг/мл иоднитротетразолиевого фиолетового. Реакцию останавливают через 10 мин 0,2 М соляной кислотой. Контролем служит пробирка, содержащая аналогичные реагенты, через которую воздух не барботировали.

Расчет концентрации этанола проводили по формуле

20

(ЭТАНОЛ) ( Рунтр ) 6.57

мкг/л воздуха,

(2),

где Оопыт и Оконтр - оптические плотности раствора в опытной и контрольной пробах при 510 нм;

V - общий объем барботируемого через индикаторный раствор выдыхаемого воздуха;

6,57 - коэффициент пересчета 1 мкг этанола на 1 л выдыхаемого воздуха.

При наличии этанола в выдыхаемом воздухе раствор окрашивается в красный цвет, окраска которого при фиксации соляной кислотой может сохраняться в течение 4-6 недель при сохранении в темноте при +4°С. Данные приведены в табл. 1-2. Предложенный способ позволяет повысить чувствительность определения этанола до 10-12 раз.

Формула изобретения 1. Способ определения концентрации этанола в биологическом материале и выдыхаемом воздухе путем взаимодействия пробы с раствором, содержащим НАД, алкогольдегидрогеназу, с последующим фо- тометрированием, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности

способа, используют алкогольдегидрогеназу из семян пшеницы, в раствор дополнительно вносят иоднитротетразолий фиолетовый.

2. Способ по п. 1,отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительно сти и точности при работе с биологическим материалом, пробу предварительно подвергают микроперегонке.

3. Способ поп. 1,отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа при работе с выдыхаемым воздухом, пробу барботируют через полученный раствор.

Способ определения концентрации этанола в биологическом материале и выдыхаемом воздухе относится к области медицины, в частности к судебно-медицинской экспертизе для определения степени опьянения и диагностики предрасположенности к алкоголизму. С целью повышения чувствительности и точности способа при работе с биологическим материалом его предварительно подвергают микроперегонке, пробу вносят в раствор, содержащий НАД, алкогольдегидрогеназу из семян пшеницы, иоднитротетразолий фиолетовый с последующим спектрофотометрированием. При определении этанола в выдыхаемом воздухе последний барботируют через указанный раствор. Использование изобретения позволяет повысить чувствительность определения этанола до 10 - 12 раз. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

Определение концентрации этанола в выдыхаемом воздухе

Таблица 2

Определение концентрации этанола D цельной крови, сыворотке крови и гомогенатах тканей предложенным способом и способом-прототипом

Алкогольде гндро- генеза печени лошади (прототип)12 21,4 16,6 542t 25 42 750+ 15 46 53,±

65,349,Ь117 137

Алкогольде гид ро- гвнаэа зерен пшеницы12

Т а б л и ц а 1

Р 0.01

Р«Х,01

P-fO.Oi

14 8,9 54,4+ 25 8,3 82+ 15 7,4 8Н 2423 21,8

Р 0,01

,01