СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ Российский патент 1995 года по МПК C12N9/02 C12Q1/26 

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине, биохимии и может быть использовано для определения активности алкогольдегидрогеназы (АДГ).

Исследованию активности алкогольдегидрогеназы в тканях придают большое значение для оценки механизмов толерантности и характеристики фармакодинамики этанола в организме. Существующие в настоящее время методы определения активности фермента являются недостаточно точными из-за наличия ингибиторов АДГ, что подтверждено в исследованиях. Поэтому в исследованиях встает задача повышения точности определения активности АДГ в ткани без влияния естественных ингибиторов фермента, присутствующих в ткани.

За прототип изобретения выбран метод определения активности алкогольдегидрогеназы в ткани. Активность фермента определяется в среде следующего состава: 2,7 мл (0,1 М Глицин-NaOH буфер, рН 9,0). 0,1 мл (0,04 М НАД); 0,1 мл (0,75 М этанол); 0,1 мл гомогената ткани. Активность фермента выражали в нмоль НАДН/мин на мг белка. Однако данный способ имеет существенный недостаток. Он не учитывает наличие ингибирующего эффекта на алкогольдегидрогеназу в ткани. В результате активность фермента при определении получается заниженной, что не позволяет правильно оценить реальные возможности ферментативной системы метаболизма этанола.

Техническим результатом изобретения является повышение точности определения активности алкогольдегидрогеназы в ткани.

Технический результат в способе определения активности АДГ, включающем взятие печени, приготовление гомогената, определение в нем активности фермента метаболизма алкоголя, достигается тем, что определение активности алкогольдегидрогеназы проводят в присутствии ионов Са²⁺ для устранения влияния ингибиторов на фермент.

Определение активности алкогольдегидрогеназы предлагаемым способом ранее нигде не использовалось. В эксперименте было установлено, что в присутствии ионов Са²⁺ влияние эндогенных ингибиторов на АДГ устраняется, что позволяет определить реальную активность фермента в ткани.

Таким образом, на основе экспериментальных исследований о влиянии ионов Са²⁺ на активность АДГ разработан способ определения активности алкогольдегидрогеназы в ткани. Положительный эффект предлагаемого способа заключается в повышении точности определения активности алкогольдегидрогеназы на 42%к в результате определения активности фермента в ткани в присутствии ионов Са²⁺.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Экспериментальное животное (крыса) умервщляют декапитацией. Извлекают печень и готовят гомогенат в среде следующего состава (0,25 М сахароза, трис-НСl, рН-7,4) в соотношении 1 г ткани + 9,0 мл среды. Полученный гомогенат разводят средой выделения в 5 раз и берут 0,1 мл для определения активности АДГ. Определение активности фермента проводят в среде следующего состава: 2,6 мл (0,1 М Глицин-NaOH буфер, рН 9,0); 0,1 мл (0,04 М НАД); 0,1 мл (0,75 М этанол); 0,1 мл (0,001 М CaCl₂); 0,1 мл гомогената. Активность фермента выражали в нмоль НАДН/мин на мг белка, рассчитывая по формуле
Активность где Е изменение оптической плотности пробы за 1 мин;
V конечный объем пробы в кювете 3,0 мл;
6,22 ˙10^-3 коэффициент наномолекулярной экстинкции восстановленной формы пиридиновых нуклеотидов при длине волны 340 нм;
Т время 1 мин;
А количество белка в пробе определенное методом Лоури, мг.

П р и м е р. Животное (крыса, N 10, 150 г) умервщляют декапитацией. Извлекают печень и готовят гомогенат в среде следующего состава (0,25 М сахароза, трис-НСl, рН 7,4) в соотношении 1 г ткани + 9,0 мл среды. Полученный гомогенат разводят средой выделения в 5 раз и берут 0,1 мл для определения активности АДГ. Определение активности фермента проводят в среде следующего состава:2,6 мл (0,1 М Глицин-NaOH буфер,рН 9,0); 0,1 мл (0,04 М НАД); 0,1 мл (0,75 М этанол); 0,1 мл (0,001 М СаСl₂); 0,1 мл гомогената. Активность фермента выражают в нмоль НАДН/мин на мг белка, рассчитывая по формуле, описанной выше.

Полученные результаты определения активности АДГ представлены в табл. 1.

Точность определения активности АДГ в предлагаемом способе на 42% выше, чем в прототипе.

П р и м е р 2. Животное (крыса, N 14, 158 г) умервщляют декапитацией. Извлекают печень и готовят гомогенат в среде следующего состава (0,25 М сахароза, трис-НСl, рН 7,4) в соотношении 1 г ткани + 9,0 мл среды. Полученный гомогенат разводят средой выделения в 5 раз и берут 0,1 мл для определения активности АДГ. Определение активности фермента проводят в среде следующего состава: 2,6 мл (0,1 М глицин-NaOH буфер, рН 9,0); 0,1 мл (0,04 М НАД); 0,1 мл (0,75 М этанол); 0,1 мл (0,001 М CaCl₂); 0,1 мл гомогената. Активность фермента выражают в нмоль НАДН/мин на мг белка, рассчитывая по формуле, описанной выше.

Полученные результаты определения активности АДГ представлены в табл. 2.

Точность определения активности АДГ в предлагаемом способе на 45% выше, чем в прототипе.

П р и м е р 3. Животное (крыса, N 19, 140 г) умервщляют декапитацией. Извлекают печень и готовят гомогенат в среде следующего состава (0,25 М сахароза, трис-НСl, рН 7,4) в соотношении 1 г ткани + 9,0 мл среды. Полученный гомогенат разводят средой выделения в 5 раз и берут 0,1 мл для определения активности АДГ. Определение активности фермента проводят в среде следующего состава: 2,6 мл (0,1 М Глицин-NaOH буфер, рН 9,0); 0,1 мл (0,04 М НАД); 0,1 мл (0,75 М этанол); 0,1 мл (0,001 М CaCl₂₎; 0,1 мл гомогената. Активность фермента выражают в нмоль НАДН/мин на мг белка, рассчитывая по формуле, описанной выше.

Полученные результаты определения активности АДГ представлены в табл.3.

Точность определения активности АДГ в предлагаемом способе на 43% выше, чем в прототипе. Сводные результаты исследования определения активности алкогольдегидрогеназы представлены в табл. 4.

Проведенные исследования показали, что точность определения активности алкогольдегидрогеназы в ткани, предлагаемым способом, повышается на 42% по сравнению с прототипом.

Использование: в экспериментальной биологии, в медицине и биохимии. Сущность изобретения: приготавливают гомогенат печени и определяют активность алкогольдегидрогеназы в присутствии ионов Ca²⁺ в концентрации 10^-4M. 4 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ, включающий взятие печени, приготовление гомогената, определение активности фермента в инкубационной среде, отличающийся тем, что активность алкогольдегидрогеназы в ткани определяют в присутствии хлористого кальция в концентрации 10^-4 моль.