СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ МАЛОНОВОГО ДИАЛЬДЕГИДА С ПОМОЩЬЮ ТИОБАРБИТУРОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 G01N33/50 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в биохимических лабораторных методах исследования.

Цель изобретения - повышение чувствительности и точности определения малонового диальдегида в биологическом материале. Поставленная цель достигается тем, что для анализа используются минимальное количество сыворотки крови или гомогената (0,2 - 0,5 мл), растворение ТБК и инкубацию образца проводят в присутствии тритона X-100, смесь перемешивают с постоянной частотой колебаний (120 качаний в мин), реакцию останавливают дигидрокверцетином; перед определением оптической плотности образца добавляется трилон Б и смесь этанола с хлороформом в соотношении (7:3).

В основе метода лежит реакция между малоновым диальдегидом (МДА) и тиобарбитуровой кислотой, которая при высокой температуре и кислом значении pH протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы тиобарбитуровой кислоты. Максимум поглощения комплекса приходится на 532 нм.

Приготовление рабочих растворов.

Рабочий раствор тиобарбитуровой кислоты (ТБК) готовили путем растворения навески ТБК 864 мг в 100 мл смеси, содержащей 1% раствор тритона Х-100 и 8,2 М раствор этанола. Остальные растворы готовили на бидистиллированной воде.

Пример 1. Определение скорости перекисного окисления липидов в отсутствие прооксиданта. 1,5 мл сыворотки или гомогената ткани инкубировали 30 мин при температуре 40^oC, при постоянном перемешивании с частотой 120 качаний в 1 мин. Реакцию останавливали 0,2 мл 3 мМ раствором дигидрокверцетина. Затем к исследуемому образцу последовательно добавляли 0,5 мл 1% раствора тритона Х-100, 0,2 мл 0,6 М раствор HCl и 0,8 мл 0,06 М рабочий раствор ТБК. Смесь нагревали в кипящей водяной бане в течение 10 мин. Охлаждение проводили при 15^oC в течение 30 мин. Для стабилизации окраски добавляли 0,2 мл 5 мМ раствор трилона Б и 5 - 10 мл смеси этанола с хлороформом в соотношении 7:3. Оптическую плотность измеряли при 532 нм. Контролем служила пробирка, в которую добавляли все эти же растворы, только вместо сыворотки или гомогената добавляли бидистиллированную воду. В расчетах МДА использовали молярный коэффициент экстинкции ε = 156 мМ^-1•см^-1.

Пример 2. Определение скорости перекисного окисления липидов в присутствии прооксидантов.

Инкубационную смесь, содержащую 0,5 мл сыворотки или гомогената ткани, 0,2 мл 1 мМ раствор FeSO₄ и 0,3 мл 1% раствора тритона Х-100, помещали на водяную баню с температурой 40^oC на 30 мин, с постоянным перемешиванием с частотой 120 качаний в 1 мин. Реакцию останавливали 0,2 мл 3 мМ раствором дигидрокверцетина. Затем к исследуемому образцу последовательно добавляли 0,5 мл 1% раствора тритона Х-100, 0,2 мл 0,6 М раствор HCl и 0,8 мл 0,06 М рабочий раствор ТБК. Смесь нагревали в кипящей водяной бане в течение 10 мин. Охлаждение проводили при температуре +15^oC в течение 30 мин. Для стабилизации окраски добавляли 0,2 мл 5 мМ раствор трилона Б и 5 - 10 мл смеси этанола с хлороформом в соотношении 7:3. Оптическую плотность измеряли при 532 нм. Контролем служила пробирка, в которую добавляли все эти же растворы, только вместо сыворотки или гомогената добавляли бидистиллированную воду. В расчетах концентрации МДА использовали молярный коэффициент экстинкции ε = 156 мМ^-1•см^-1.

Расчет концентрации малонового диальдегида в сыворотке крови проводят по формуле:

где
D1 - оптическая плотность образца с сывороткой; D2 - оптическая плотность контроля; U1 - объем сыворотки, взятой на определение, мл; U2 - конечный объем смеси, мл; l - длина кюветы, см; ε - коэффициент экстинкции 156 мМ^-1•см^-1.

Расчет концентрации малонового диальдегида в гомогенатах ткани проводят по формуле:

где
D1 - оптическая плотность образца с гомогенатом; D2 - оптическая плотность контроля; U1 - объем гомогената, взятого на определение, мл; U2 - конечный объем смеси, мл; U3 - общий объем гомогената, мл; P - навеска ткани, г; l - длина кюветы, см; ε - коэффициент экстинкции 156 мМ^-1•см^-1; 10 - коэффициент перевода в мл.

Описание прототипа [1].

Метод применяется для определения скорости процессов перекисного окисления липидов в изолированных системах. Существуют две его разновидности: в одной определяется скорость спонтанного, во второй - скорость перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот (НЖК), индуцированного прооксидантами. В случае определения скорости спонтанного неиндуцированного перекисного окисления изолированный препарат биомембран или гомогенат инкубируют в аэробных условиях без каких-либо добавок или воздействий, стимулирующих процессы перекисного окисления.

Пример 1. Определение скорости перекисного окисления в отсутствие прооксидантов.

Инкубационную смесь, содержащую 50 мМ трис-HCl буфер (pH 7,4) и суспензию клеточных органнелл или тканевой гомогенат в количестве 1 - 10 мг белка/мл, помещают в водяную баню (t = 37^o) и инкубируют при постоянном встряхивании. Пробы объемом 1,9 мл отбирают в центрифужные пробирки через различные сроки инкубации. Реакцию останавливают добавлением 0,1 мл 100% раствора ТХУ, 0,2 мл 5 М HCl и 2,0 мл 0,75% ТБК. Затем смесь нагревается в горячей водяной бане в течение 15 мин и центрифугируется. Оптическая плотность измеряется при 535 нм. Молярный коэффициент экстинкции ε = 156 мМ^-1•см^-1.

Пример 2. Определение скорости перекисного окисления в микросомальной фракции в присутствии прооксидантов.

В качестве прооксидантов добавляются НАДФН или аскорбиновая кислота, а также ионы Fe²⁺ (или Fe³⁺). Для НАДФН-стимулируемой ферментной системы обязательным является добавление пирофосфата или нуклеотидов с пирофосфатными группировками. В случае аскорбат-зависимой системы вполне достаточно одних ионов Fe²⁺ (Fe³⁺). Состав инкубационной смеси: белок микросом 0,5 - 1,0 мг/мл; трис-HCl буфер 40 мМ (pH 7,4); восстановленный НАДФ 1 мМ или аскорбат 0,8 мМ; Fe(NH₄)₂(SO₄)₂•6H₂O 12 мкМ; Na₄P₂O₇•10H₂O 20 мМ. В некоторых случаях используют вместо НАДФН глюкозо-6-фосфатдегидрогеназную НАДФ-генерирующую систему, содержащую 0,3 мМ НАДФ⁺, 8мМ MgCl₂, 9 мМ глюкозо-6-фосфат Na, 50 мМ никотинамид и 1 - 2 мкг глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в пробе. Объем пробы 1,0 мл. Инкубацию проводят на водяной бане (t = 37^oC) в течение 20 мин при постоянном встряхивании сосудов. Реакцию останавливают добавлением 1,0 мл 30% ТХУ и осадок удаляют центрифугированием в течение 10 мин при 6000 об/мин (Владимиров Ю.А., Арчаков И.М. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972, с. 241 - 242).

Предполагаемые недостатки прототипа
1. ТБК плохо растворима в воде и при комнатной температуре выпадает в осадок, поэтому каждый раз ТБК необходимо разогревать на кипящей водяной бане, что связано с тратой времени и энергии.

2. ТХУ не может полностью остановить протекание свободнорадикальных реакций, поэтому для полной остановки реакции необходимо использовать антиоксидант (дигидрокверцетин), который и предложен в данной заявке.

3. Интенсивность реакции ПОЛ очень сильно зависит от частоты перемешивания инкубационной смеси, на что в прототипе внимание не обращают.

4. Липидные фракции образца плохо растворимы в водной среде, для преодоления этого недостатка предлагается использовать тритон Х-100.

5. Триметиновый комплекс, образующийся в реакции ТБК с малоновым дидиальдегидом, но достаточно стабилен и может быстро претерпевать изменение. Для его стабилизации нами предложено использовать трилон Б.

6. Денатурированные формы белка удаляются с помощью ТХУ с последующим центрифугированием. Нами предложено производить их растворение смесью этанола с хлороформом.

Способ может быть использован в медицине и в биохимических лабораторных методах исследования. Способ повышает чувствительность и точность определения малонового диальдегида в биологическом материале. Используют минимальное количество сыворотки крови или гомогената (0,2-0,5 мл), растворение ТБК и инкубацию образца проводят в присутствии тритона Х-100, смесь перемешивают с постоянной частотой колебаний (120 качаний в мин), реакцию останавливают дигидрокверцетином; перед определением оптической плотности образца добавляют трилон Б и смесь этанола с хлороформом в соотношении (7: 3).

Способ определения концентрации малонового диальдегида (МДА) с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК), включающий инкубацию определяемого образца, проведение реакции МДА с ТБК определение концентрации МДА в образце, отличающийся тем, что, с целью интенсификации и повышения селективности реакции, растворение ТБК и инкубацию образца проводят в присутствии тритона Х-100, смесь перемешивают с постоянной частотой колебаний (120 качаний в минуту), реакцию останавливают дигидрокверцетином, перед определением оптической плотности образца добавляется трилон Б и смесь этанола с хлороформом в соотношении (7 : 3).