1
(21)4634132/13
(22) 30.06.88
(46)07 11.91. №41
(71)Всесоюзный научно-исследовательский институт охраны природы и заповедного дё- лч Госагропрома СССР, Всесоюзный научно исследовательский институт молекулярной биологии Научно-производственного объединения Вектор и Всесоюзный научно-исследовательский институт био- мегодов защиты растений ВАСХНИЛ
(72)Т.В.Теллякова. Н.В.Мацкевич. Г.Л.Шатрова и Л.Н.Налепича
(53)632.951 (088.8)
(56) Авторское свидетельство СССР № 1264393, кл. А 01 N 63/00,1983.
(54)ШТАММ ГРИБА ARTHROB OTRYS OLIGOSPORA FRES. ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ГАЛЛОВЫХ НЕМАТОД
(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению биологических средств для борьбы с гзлловыми нематодами, и представляет собой новый штамм для получения вышеуказанного средства. Целью изобретения является получение нового штамма немато- фзгового хищного гриба вида Arthrobotrys oiigocpora Fres., обладающего более высокой активностью в привлечении и уничтожении гзллооых нематод и стабильностью. Использование препарата позволяет снизить численность нематод в почве на 27 - 35% по сравнению с препаратом, полученным нэ основе известного штамма. 5 табл.
Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению биологических средств для борьбы с галловыми нематодами, и представляет собой новый штамм для вышеуказанного средства.
Целью изобретения является получение нового штамма нематофагового хищного гриба вида Arthrobotrys oligospora Fras., обладающего более высокой активностью в привлечении и уничтожении галловых нематод и стабильностью.
Штамм гриба Arthrobotrys oligospora Fres. выделен из почвы березового насаждения в окрестное ях пос.Краснообск Новосибирской обл и депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизоа Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР под номером ВКМ F - 3062 Д.
Штамм имеет следующие культурально- морфологические и физиолого-биохимиче- ские признаки. На сусло-агаре образует колонии, имеющие белый, ватообразный мицелий, плотность которого по поверхности колонии неравномерна вследствие образования небольших впадин. Обратная сторона колоний коричневого или светло- коричневого цвета.
Конидиеносцы простые, с 1 - 2 узлами на вершине. Конидии размером 27,2 х 15,1 мкм, удлиненно грушевидные, двухкле- точные, собраны в головки по шесть и более
О 00
00 00
00
конидий. Ловчие органы в виде петель, колец и их сплетений могут образовываться спонтанно на пиичтельной среде. Присутствие нематод стимулирует массовое образование колец. В табл.1 представлены данные по скорости роста штамма BKMF - 3062 Д на разных средах при температуре 20°С.
Отношение к источникам углерода. Штамм испольгуег различные вещества и субстраты: моносахара (глюкоза, арабино- за), дисахара (лактоза, мальтоза, сахароза), трехатомный спирт (глицерин), многоатомные спирты (маннит, дульцит, инозит, сорбит, рамноза), полисахарозы (крахмал), жиры (растительное масло, рыбий жир, оле- иновая кислота). Лучший рост отмечается в присутствии глюкозы, сахарозы, глицерина. крахмала, а также комплексных источников углерода (пивное сусло, меласса).
Отношение к источникам азота. Штамм использует почти все аминокислоты: ала- нин, валин норлейдин, лейцин, серии, аргинин, лизин, орнитин, аспарагин, глута- мин, фенияаланин, гистидин, триптофан, метионин, цистеин. Алании, аспараг-ин, ме тионин и триптофан стимулируют наиболь- выход биомассы гриба, а норлейцин - образование ловчих петель. Штамм способен использовать азот из неорганических источников - азотнокислого и хлористого аммония. Кукурузный экстракт, включающий комплекс азотсодержащих соединений, является наилучшим источником азота для этого гриба. Для выращивания гриба в поверхностной культуре можно использовать сусло-агар, иептонно-кукурузный агар и др. Оптимальная температура для культивирования штамма 25 - 26°С, минимальная 5 - 6°С, максимальная 29 - 30°С.
Штамм BKMF - 3062 Д маркерных признаков не имеет. Хранится штамм на агари- зованной среде (ПКА и СА) в пробирках при температуре 4 - 5°С в течение года. Для контроля за состоянием популяции проводится микроскопический контроль культуры за наличие ловчих приспособлений. Для этого при малом увеличении микроскопа просматривают препараты,полученные путем захвата культуры в разных местах колонии микробиологической иглой над пламенем спиртовки.
Для стабилизации свойств штамма 1-2 раза в год проводится моноконидиальный рассев, при котором из отвитых изолятов (не менее 100) производится отбор культур не только с характерными морфологическими признаками, но и с количеством ловушек не менее 10 в поле зрения микроскопа при увеличении 90х. Штамм характеризуется стабильностью нематофаговых свойств.
Пример 1. Получают препарат против галловых нематод. Исходная культура воспроизводится на дозированном скошенном сусло-агаре (3,5° Бел.) в молочных бутылках
в течение 7-10 сут при температуре, оптимальной для используемого штамма. В конце роста культуры выставляют на рассеянный солнечный свет, стимулирующий соотношение, после чего их можно хранить до
0 6 мес. в холодильнике и периодически использовать в качестве инокулюма для получения маточных культур,
Маточную культуру выращивают глубинным способом в колбах Эрленмейера на
5 круговых качалках, делающих 220 об/мин, или в ферментерах на жидкой среде следующего состава, г: кукурузный экстракт 0,75; меласса свекловичная 3,0; КНаНОз 0,5; MgSOd 7Ы20 0,2; NaNOa - 0,5, вода водопроводная 1000 мл, рН среды доводят до
0 7,0.
Культуральные емкости засевают спо- рово-мицелиальной суспензией, для получения которой в каждую молочную бутылку с исходной культурой гриба добавляют
5 100 мл стерильной воды, после чего бутылку энергично встряхивают, а суспензию используют по назначению. Соотношение объемов суспензии и культуральной среды равно 1:10- 1:20.
0 Ферментацию маточной культуры осуществляют в течение 3 сут. Выход биомассы по сухому веществу составляет 12-15 г/л. Для производства биопрепарата подсолнечную лузгу, помещенную на сетку, промы5 вают струей проточной воды. После ее стекания в течение 2 ч влажность субстрата становится равной 55 - 60%.
Лузгу распределяют по различным емкостям (стеклянные банки объемом 1 - 3 л),
0 заполняя их на 2/3 объема. Банки закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в течение 1 ч при 1 атм. Посев глубинной (маточной)культуры на подготовленный субстрат проводят стерильно по 10 - 20 мл в
5 банки емкостью 1 л и по 50 мл в трехлитровые банки. Затем банки тщательно встряхивают и помещают в горизонтальное положение в термостат при 25 - 28°С на 10 - 12 дней. В последние два дня их выставляют
0 на солнечный свет.
Сушат биопрепарат при температуре не более 30°С, хранят его в бумажных мешках при температуре 24 - 18°С в течение 6 мес. Полученный биопрепарат представляет со5 бой субстрат (подсолнечную лузгу), частицы которого покрыты спорами и мицелием гриба. Основой препарата являются конидии и мицелий хищных грибов в виде Arthrobotrys oligospora Fres. В 1 кг препарата содержится не менее 2 - 5x10 жизнеспособных конидий и 98% субстрата. Биопрепарат, изготовленный описанным способом, рекомендуемся против галловых нематод, поражакнчих овощные культуры в защищенном грунте.
П р и м е р 2. Применение препарата в лабораторных условиях, Аттрактивная способность, являющаяся составной частью механизма хищничества нематофаговых грибов, у данного штамма проявляется значительно сильнее, чем у штамма BKMF - 2461 Д. В лабораторном эксперименте на аттрактивный и нематофаговый эффект использовали культуры сравниваемых штаммов, выращенные на агаризованной питательной среде (сусло-агао пептонно- кукурузный агар) В чашечки Петри диаметром 30 мм вносили суспензию нематод Panagrelius redivr us G. В центр чашечки помещали высечки культур грибов диаметром 3 мм. При помощи стереоскопического микроскопа проводили наблюдения за перемещением нематод в блок культур гриба и через 2 ч проводили их подсчет (см. табл.2),
В лабораторных условиях гибель нематод у штамма BKMF - 3062 Д наступает быстрее, 100%-ная гибель в указанном эксперименте наблюдалась через 1 сут, а у штамма BKMF-2 61 Д-через2 сут. Данные электронно-микроскопического исследования свидетельствуют о присутствии мицелия штамма BKMF - 3062 Д в теле нематод уже через 12 ч.
Предлагаемый шгамм BKMF - 3062 Д характеризуется большей стабильностью и активностью свойств по сравнению со штаммом BKMF - 2461 Д.
При работе со штаммом BKF - 2471 Д обнаружено появление в колониях секторов и пятен, в то время как морфология колоний предлагаемого штамма с момента выделения из природы при пересевах остается постоянной.
Проведение цитокариологического анализа в процессе онтогенетического развития этих штаммов с помощью окраски НС- Гимза показало, что базальные клетки кони- диеносцев и конидий штамма BKMF - 2461 Д преимущественно многоядерны, а ядра различаются по форме и величине, а между клетками конидиеносцев и гифами мицелия обнаружено наличие анастомозов. D отличие JDT этого у штамма BKMF - 3062 В преобладает одноядерность базальных клеток конидиеносцев и конидий, не обнаружены анастомозы между клетками конидий и гифами мицелия. Эти данные вскрывают причину нестабильности штамма BKMF - 2461
Д. плорач заключаетсп л ютг р ариошч П) сти 6азал1 шх клеток ШНИДИРИОСЦСР и конидий.
В отличие от предлагаемого штамма BKMF 3062 Д, который обладает природнм- ми свойствами активности и стабильности, штамм BKMF-2461 D получен многоступенчатым моноконидиэльным отбором и является по сути искусственным штаммом, который сохраняется без изменения 5 лет.
0Для успешного применения хищных
грибов в качестве продуцентов биопрепарата для борьбы с галловыми нрматодами необходимо изучение их свойств не только в лабораторных условиях, но и в почве, т.е. в
5 условиях практического использования штаммов.
Для изучения поведения предлагаемого штамма и известного в почве использовали метод мембранных камер, суть которого со0 стоит в том, что на миллипоровые фильтры наносится суспензия спор исследуемых штаммов грибов, фильтры закладываются а камеры (из стеклоткани) и помещаются в почву, В динамике (после фиксации и
5 окрашивания фильтров карболовым эритро- зином) проводится подсчет на фильтрах ло-. вушек хищных грибов и формирующихся в почве хламидоспор. Данные представлены в табл.3.
0Как видно из табл.3, в почве к 14-м сут
у штамма BKMF - 3062 Д число ловушек в шесть с лишним раз превышает таковое у штамма BKMF - 2461 Д, а резкое возрастание к концу месяца числа хламидоспор сви5 детельствует о лучшей адаптации предлагаемого штамма к условиям почвы и приживаемости в ней.
П р и м е р 3. Применение препарата в полевых условиях. Эффективность препара0 та на основе штамма BKMF - 3062 Д была подтверждена в условиях производственного опыта в теплице на растениях огурца сорта Эстафета - 87, Опыт был заложен. 18 февраля 1988 г. и продолжался до 29 сентяб5 ря того же года. Воздушно-сухой препарат на подсолнечной лузге на основе штаммов BKMF - 2461 Д и BKMF - 3062 Д вносили в дозе 50 г на 1 кв.м. Варианты опыта: биопрепарат на основе штамма BKMF - 2461 Д;
0 биопрепарат на основе штамма BKMF - 3062 Д; контроль (чистый); контроль (применение нематоцида гетерофоса).
После окончания опыта проведен анализ корневой системы растений на наличие
5 галлов по пятибалльной шкале и проведен подсчет численности нематод в почве. Данные представлены в табл.4 и 5.
Как видно из табл.2 и 3, биопрепарат на основе штамма BKMF-3062 D оказался болееактивным в уничтожении нематод. Снижение численности нематод в почве по отношению к чистому контролю составило у биопрепарата на основе штамма BKMF - 2461 Д 59,4%, на основе штамма BKMF - 3062 Д - 86,2%. По отношению к контролю с гетерофосом соответственно 46,5% и 81,9%. Таким образом, предлагаемый штамм превосходит изримечание. СА - сусло-агар (5 Бел); ПКА - пептонно-кукурузный агар, г/л: глюкоза Ю; хлористый натрий 5; углекислый кальций 0,5; кукурузный экстракт 5; пептон 5; агар- агар 2(1; Ч - среда Чапека, г/л: сахароза 30,азотнокислый натрий 2; сернокислый магний 0,5; сернокислое железо 0,01; хлористый калий 0,5; .калий фосфорнокислый одноза- мещенный 1; агар-агар 20.
Таблица2
Штамм
Процент нематод в блоке культур гриба
вестный на 27 - 35% по способности уничтожать личинок нематод в почве.
Формула изобретения Штамм гриба Arthrobotrys ollgospora Fres.BKMF - 3062 Д для получения препарата против галловых нематод.
Таблица 1
ТаблицаЗ
Биопрепарат на основе штамма BKMF-2461 Д Биопрепарат на основе штамма BKMF-J062 Д Контроль (чистый) Контроль (с гетеро- фосом)
Т а б л и ц с) 4
38,6
3,7 43,1
42,4
Т а б л и ц а 5
