Способ получения генетически трансформированных растительных объектов Советский патент 1991 года по МПК C12N15/82 

Изобретение относится к клеточной и генетической инженерии, а именно к получению клеточных линий и растений с ноаы- ми наследственными свойствами.

Целью изобретения является трансформация как одиночных клеток, так и клеток в составе растительных структур различных видов растений и повышение количества трансформированных клеток.

Предлагаемый способ состоит, из следующих этапов:

подготовка объекта-реципиента (выделение протопластов, клеток, каллусов, получение меристели и эмбрионов и т.д.), подготовка трансформирующих факторов (выделение плазмид, митохондрий, хлороп- ластов), изготовление микроинструмента, фиксация микроинструмента и фиксация объекта в камере (присоска, заливка в агар и механическая фиксация), заполнение иглы

трансформирующим фактором (либо с кончика иглы, либо с противоположного конца), введение кончика иглы в объект-реципиент, инъекция, перенесение инъецированных объектов на -питательную среду, перенос объектов на селективную среду, отбор трансформантов, регенерация трансформированных растений.

П р и м е р 1. Инструменты для манипуляций изготавливают из стандартных заготовок - стеклянных капилляров диаметром 1 мм на микрокузнице. Используют три вида инструмента: микроиглу, диаметр кончика менее 1 мкм, микроприсоску, диаметр 10 мкм и коллектор для отбора инъецированных объектов, диаметр 100 мкм.

Протопласты, выделенные из каллуса Nicotlana debneyl по стандартной методике, помещают в микрокэмеру в стерильном ламинарном боксе. С помощью комплекса

О

ю

ю о

микроманипуляторов КМ-2, в протопласт вводят микроиглу, выдавливают через нее плазмиду pSV2NeO, коллектором отбирают инъецированную клетку и помещают ее на питательную среду.

Из 93 инъецированных протопластов получено 13 клеточных линий, устойчивых к канамицину и способных к росту на среде, содержащей 30 - 240 мг/л антибиотика ка- намицина сульфата. Эффективность трансформации составляет 14%. Из трех устойчивых линий регенерированы растения,

П ример2. Инструменты и проведение эксперимента аналогично примеру 1. Одиночные клетки N.tabacum, полученные из регенерирующих протопластов на 2-7-й день после выделения, трансформируют плазмидой pS V2-Neo, Из 20 инъецированных клеток получено 3 клеточные линии, устойчивые к канамицину и способные к росту на среде, содержащей 30 - 240 мг/л антибиотика канамицина сульфата.

П р и м е р 3. Получают микроколонии клеток Lycoperslcon esculentum из одиночных клеток. В камеру помещают микроколонию в агаре, в одну из клеток вводят микроиглу и выдавливают плазмиду pGV0319, При введении в 95 микроколоний получено 18 клеточных линий, способных к росту на безгормонал1 ной среде. Эффективность трансформации составляет 19%. Трансформированные микроколонии переносят на питательную среду.

Пример 4. В корневой волосок Trlamea bogotensis (бесцветная, не содержащая хлоропласгов клетка) в 10 спыгах были вверены хлоропласты Nlcotlana tabacum. Для этого растение Т.bogotensis

помещают в камеру на предметном столике микроскопа и через микроиглу диаметром кончика 3-5 мкм выдавливают хлоропласты. Хлоропласты в микроиглу набирают с пр..

тивоположного конца. После инъекц..л растение помещают в среду для выращиванич. Через неделю после введения хлороп- ласты были найдены в 9 клетках - корневнх волосках, значительно выросших ja это время.

Эффективность предлагаемого способа заключается в значительном повышении эффективности трансформации растительных клеток до 10-20% по сравнению с максимально достигаемым (1%) уровнем у известных способов; универсальности по отношению к объектам-оеципиентам и трансформирующим факторам; с.андартно- сти манипуляций необходимых для получения широкого круга трансформантов; вовлечении в генноинженерные манипуляции широкого круга сельскохозяйственно важных растений, например злаковых. Формула изобретения

Способ получения генетически трансформированных растительных объектов, о т- личающийся тем, что, с целью трансформации как одиночных клеток, так и клеток в составе растительных структур

различных видов растений и повышения количества трансформированных клеток, . трансформацию осуществляют выдавливанием экзогенного молекулярно-генетиче- ского материала и автономию

реплицирующихся клеточных органелл через микроиглу, введенную в клеi ку, с после- дующей селекцией клеточных линий и растений с новыми наследственными свойствами.

0

Изобретение относится к клеточной и генетической инженерии, а именно к получению клеточных линий и растений с новыми наследственными свойствами. Целью изобретения является трансформация как одиночных клеток, так и клеток в составе растительных структур различных видов растений и повышение количества трансформированных клеток. Способ получения генетически трансформированных растительных объектов состоит из следующих этапов: подготовка объекта-реципиента и трансформирующих факторов, изготовление микроинструмента, фиксация микроинструмента и объекта в камере, дополнение микроиглы трансформирующим фактором, введение иглы в объект-реципиент, инъекция, перенос инъецированных объектов на питательную, а затем на селективную среду, отбор трансформантов и регенерация трансформированных растений.