Способ получения двудольных растений, устойчивых к сульфонилмочевине Советский патент 1993 года по МПК C12N15/84 

Изобретение относится к генетической инженерии, а частности к получению фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу, устойчивую к гербициду. . Сульфометуронметил и хлорсульфурон ингибируют рост некоторых бактерий, дрожжей и высших растений путем ингиби- рования ацетояактдтсинтазы (АЛС), первый общий фермент в биосинтезе аминокислот (валин, лейцин и изолейцин)с разветвленной цепью. Три основных изофермента АЛ С, обозначенные I, II и III, идентифицированы в кишечных бактериях. Изоферменты I и III, но не II, являются чувствительными к инги- бированию конечного продукта валином. Каждый из трех бактериальных изоэнзимов содержит большую и малую субъединицы белка. Энзимы АЛ С из дрожжей Saccharo- myces cerevlslae и из некоторых высших растений частично охарактеризованы и показывают некоторую степень ингибирования конечного продукта. Неизвестно, состоят ли энзимы АЛС.дроссей и растений из одного или более различных полипелтидов. Данные дают основание предполагать, что местоположение энзимов АЛ С дрожжей и растений находится соответственно в митохондриях и хлоропластах.

Известно выделение генов, кодирующих энзимы АЛ С из кишечных бактерий Salmonella typhimurium и Escherichla coll. a также дрожжей S.cerevlsiae. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих две субъединицы изоэнзимов I. II и III АЛ С E.cpll, показывают, что они организованы как опероны HvBN. llvGM и ilvlH соответственно. Сравнение выведенных аминокислотных .последовательностей больших

00

ю

О О

СА

субъединиц изоэнзимов АЛС E.coli показывают три участка, содержащих приблизительно 50% консервативных аминокислот, на приблизительно 2/3 состоящих из бел- -ков и разделенных участками с малоразличимой гомологией. Консервативные аминокислотные последовательности встречаются также и среди малых субъединиц бактериальных изоферментов. В дрожжах S.cerevislae был идентифицирован единственный ген ILV2, кодирующий активность АЛС. Анализ нук- леотидной последовательности гена ILV2 выявил, что полипептид, кодируемый им, гомологичен большим субъединицам бактериальных изоферментов АЛС. Аминокислотная последовательность АЛС дрожжей характеризуется такой же структурной организацией и степенью гомологии, которая наблюдается между большими субъединицами бактериальных изоферментов, за исключением того, что около девяноста аминокислот в аминоконце дрожжевого белка обеспечивают перенос белка в митохондрию. Ранее не было никакой информации относительно структуры генов растений, кодирующих АЛС, или аминокислотной последовательности энзимов АЛС растений.

Изофермет I кишечных бактерий представляет собой единственную известную АЛС в природе, которая является нечувствительной к ингибированию сульфометурон- метилом и хлорсульфуроном. Поэтому кишечные бактерии чувствительны к этим гербицидам только в присутствии валика, который иншбирует изофермент I. Идентифицированы сульфонилмочевинные герби- цидустойчивые мутантные формы кишечных бактерий Salmonella typhlmurlum и E.coli (отобранные в присутствии валина), дрожжей S.cerevislae и высших растений Nlcotiana tabacum (табак), Arabldopsls thaliana и Zea mays (кукуруза) .Эти мутантные фенотипы совместно расщепляются к гербицидустойчивым формам АЛС посредством генетических кроссов. BS.typhimu- rium гербицидустойчивые мутации связаны с геном, кодирующим АЛС, а в E.coli и S.cerevislae эти мутации заключены в структурных генах для АЛС. В высших растениях мутации, ответственные за устойчивость, наследуются как единственные доминантные или полудоминантные ядерные признаки. В табаке эти мутации картируются по одному из двух несцепленных генетических локусов. Хотя многие гены, вовлеченные в структуру и функцию дифференцированных растительных тканей и органов, не экспрес- сируются в недифференцированных тканях, те, которые участвуют в основных клеточных функциях, экспрессируются и могут быть отобраны в дезорганизированном

каллюсе или культуре клеточной суспензии. Это демонстрировалось во многих случаях путем отбора фенотипа в тканевой культуре, из которой были регенерированы растения, экспрессирующие такой же фенотип.

Известен способ получения двудольных растений, устойчивых к сульфонилмочеви- не, предусматривающий получение суспен- зионных каллусных культур, отбор клеток,

культивирование каллуса и получение регенёрантов, устойчивых к гербициду.

Поскольку ацетолактатсинтетаза представляет собой энзим, вовлеченный в аминокислотный биосинтез, было продемон5 стрировано, что гены, кодирующие этот фермент, экспрессируются в каллюсовой ткани так же, как и в целом растении. Мутанты табака S4, СЗ и Нга. устойчивые к сульфо- нилмочевине и описанные в этом патенте,

0 вначале были отобраны в тканевой культуре и затем регенерированы в целые растения, в которых устойчивые фенотипы были сохранены генетически стабильным образом. Каллюсные ткани, происходящие от регене5 рированных растений или их потомства, продолжают расти при концентрациях гербицида, которые ингибируют рост кал л юса дикого типа. Таким образом, устойчивость к гербициду на основе сульфонилмочевины

0 на клеточном.уровне растений указывает на устойчивость на уровне целого растения.

Существуют ограничения для получения гербицидустойчивых сельскохозяйственных растений посредством тканевой культу5 ры или обработки семян мутагеном: 1) метод культуры тканей ограничен теми культурами растений, которые могут подвергаться манипулированию в тканевой культуре и регенерации из тканевой культуры, 2) растения,

0 происходящие от обработанных мутагеном семян и может быть из тканевой культуры, могут иметь нежелательные фенотипы, которые потребуют отщепления многочисленных генетических обратных скрещиваний и

5 3) перенос устойчивого гена путем размножения был бы ограничен культурными сортами одних и тех же видов, а также потребовал бы осуществления многократных генетических обратных скрещиваний. Поэтому выде0 ление фрагмента нуклеиновых кислот, способного придать гербицидную устойчивость, и его последующее введение в сельско- хозяйственные культуры посредством генетической трансформации позволяет осу5 ществить быстрый межвидовой перенос гер- бицидной устойчивости и устранить многие из указанных ограничений.

Многие гены, выделенные из одного растения, были введены и экспрессированы в других растениях, нерастительные гены

были экспрессированы в растениях только как химерные гены, в которых кодирующие последовательности нерасгительных генов были сплавлены с растительными регуля- торнымй последовательностями, необходимыми для экспрессии генов. Однако было бы трудно ввести гербицидную устойчивость в растения путем введения химерных генов, состоящих из бактериальных или дрожжевых генов, кодирующим гербициду- стойчивую форму АЛ С, поскольку а) эти микробные АЛОэнзимы, как полагают, не содержат специфической сигнальной (транзитной) пептидной последовательности, необходимой для ввода в растительные хлоропласты, представляющие собой клеточное местоположение растительной АЛ С, б) бактериальные изоферменты состоят из двух различных полипептидных субъединиц и в) микробные АЛС-ферменты не могут функционировать оптимально в чужеродной клеточной среде высших растений. Следовательно, Существует необходимость во фрагментах нуклеиновых кислот, которые кодируют гербицидустойчивую форму растительной АЛ С и которые придают гебицид- ную устойчивость, когда они введены в гербицидчуветвительные растения.

Предлагается использование фрагмен та нуклеиновых кислот, кодирующего ацето- лактатсинтетазу растений, встроенного в конструкцию нуклеиновых кислот, используемую для трансформации растений/содержащих ацетбяактатсинтетазу дикого типа, которые являются чувствительными к гербицидному соединению сульфонилмоче- вины, причем указанный фрагмент нуклеиновых кислот имеет по крайней мере одну точковую мутацию относительно фрагмента нуклеиновых кислот дикого типа, кодирующего аце- толактатсинтётазу растений таким образом, что при трансформации указанной конструкцией нуклеиновых кислот указанное растение приобретает устойчивость к внесению гербицидного соединения сульфонилмочевины.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Получение фрагментов ДНК, кодирующих гербицидустойчивую АЛС.

Каллюснеые культуры чувствительного к гербициду табака (Nicotfana tabacum, разновидность Xonthl) подвергают воздействию сульфометуронметила при 2 ч. на млрд. Отбирают устойчивые клеточные линии, обозначенные СЗ и S4. Стандартный генетический анализ растений, регенерированных из этих клеточных линий, показывает, что каждая из линий СЗ и S4 несет единственную полудоминантную ядерную генную мутацию, отвечающую за признак

устойчивости к гербициду, а также то. что мутации СЗ и S4 не связаны генетически, т.е. находятся в различных генах, обозначенных SURA и SURB соответственно. Как локазы- 5 вает анализ, линии СЗ и S4 продуцируют активность энзима АЛС, в 100 раз более устойчивого к сульфонилмочевинным герби- цидам-хлорсульфурону и сульфометуронме- тилу, чем АЛС дикого типа. Устойчивость АЛС

0 к гербициду в генетических кроссах выделяется вместе с устойчивостью к ингибирова- нию роста гербицидами. Наблюдение двух различных генов, которые мутировали с образованием гербициду- стойчивой АЛС, не

5 было неожиданным, поскольку N.tabacum, как полагают, представляет собой аллотет- раплоид,образованный из N-tomentosfformls и N.sylvestris. по существу содержащих два полных генома. Так, каж0 дая клеточная линия СЗ и S4 содержит один мутант и один ген АЛС дикого типа. Клеточную линию S4 подвергают воздействию сульфометуронметила при 200 ч. на млрд., избирательная концентрация которого пол5 ностью ингибирует рост S4. Идентифицируют клеточные линии, устойчивые к 200 ч. на млрд., одну такую линию обозначают Нга. Испытания показывают, что Нга выдерживает концентрации сульфомету- ронметила,

0 которые в 1000 раз выше, чем те/которые требуются для полного ингибирования роста каллюса дикого типа. Как показывает анализ, линия Нга кросс устойчива к хлорсульфурону. Растения регенерируют из

5 каллюсных культур Нга. Генетический анализ растений показывает, что мутации Нга и S4 связаны, что говорит о том, что линия Нга содержит вторую мутацию в мутантном гене прародительной линии S4. Определяют ак0 тйвность АЛС в экстрактах листьев дикого типа и растениях табака гомозиготного мутанта Нга. Активность АЛС в экстракте из растений мутанта Нга приблизительно в 1000 раз-более устойчива к хлорсульфурону,

5 чем активность растений дикого типа.

Для того, чтобы клонировать устойчивый к гербициду ген АЛС, ДНК табака выделяют из гомозиготной мутантной линии S4 Nlcotiana tabacum. Порции по 50 г кал л юс ной

0 ткани замораживают в жидком N2 и затем лиофилизуют, Полученную высушенную ткань потом измельчают при температуре около 23°С в мешалке с использованием 15- секундных импульсов до превращения в по5 рошок. 10 объемов сахарозного буферного раствора (Oi3M сахарозы у 50 мМ трис-НС1 рН 5, 5 мМ MgCla) прибавляют к смеси и полученную суспензию инкубируют при 0°С в течение 5 мин. Суспензию фильтруют че- рёэ марлю и центрифугируют при 350 х g в

течение 10 мин. Ядерный осадок в виде гранул ресуспендируют в лизисном буферном растворе (20.мМ ЭДТК, 50 мМ трис-ЧНС рН 8, t % Sarkosyl), прибавляют CsCI с получением 0,95 г на мл буферного раствора и полученную смесь центрифугируют при 17000 х g в течение 20 мин при 4РС. ЭТидий бромид прибавляют к полученному супер- натанту до концентрации 400 мкг на мл, показатель преломления регулируют до 1,39 и полученный раствор центрифугируют при 90000 х g в роторе типа Beckman TI 70 при 20°С в течение 3 суток. .Полученную флуоресцентную полосу ДНК отщепляют от градиента и обрабатывают изопропанолом для экстрагирования этидий бромида, В заключение ДНК диализуют против буфера ТЕ и осаждают путем прибавления этанола.

Из этой ДНК получают геномнуюбибли- отеку Nicotiana следующим образом, используя лямбда-вектор фага EMBL4. Фаг ЕМBL4 получают из биомассы с агарозных чашек. Получают фаговую ДНК путем кон- центрирования фага полиэтиленгликолем, удаления полиэтиленгликоля хлороформом и очистки фага с использованием ступенчатых градиентов глицерина. Полученный очищенный фаг затем обрабатывают дезок- сирибонуклеазой и«рибонуклеазой перед экстракцией фенолом. Фаговую ДНК извлекают из этанола. Для получения плеч фага EMBL4 фаговую ДНК псоледовательно гид- ролизуют эндонуклеазами Sal I и Bam HI. Плечи отжигают и затем отделяют от цент- рального фрагмента на 10-40%-ном саха- розном градиенте. Плечи:полностью денатурируют и повторно .отжигают перед лигированием к ДНК табака. ДНК табака, полученную описанным образом, частично обрабатывают эндонуклеазой SAU3A и осаждают посредством градиента 10-40 %- ной сахарозы. Фракции от сахарозного гра- дие.нта затем анализируют электрофорезом на 0,5%-ых агарозных гелях. Фракции, со- держащие фрагменты в диапазоне размеров 20-40 кб, диализуют, осаждают и липируют к плечам ДНК лямбда-фага. ДНК лигируют при концентрации 135 мкг на мл вектора и 45 мкг на мл вставки ДНК. Пол- ученные лигированные контактамеры затем упаковывают с использованием экстрактов упаковки.лямбда-ДНК. Выход фага составляет приблизительно 4,5 х 10 фагов на мкг вставки ДНК, Конструируют библиотеку из приблизительно 400000 фагов, представляющую примерно 99%-ную полную библиотеку для табака, которая имеет приблизительно геномное содержанием 1,65 пикограммов или 1,52 х 10 пар оснований.

Полученную фаговую библиотеку ДНК Nicotiana выращивают и высевают на чашки на штамме LE392 „E.coli (АТСС 33572). Фаги высевают на чашки с получением 2000-5000 пятен на 90 мм чашках Петри или 50000 пятен на 150 мм чашках Петри. Вслед за переносом фаговрй ДНК к нитроцеллюлоз- ным фильтрам последние предварительно гибридизируют путем инкубирования в течение приблизительно 4 ч при 56°С в б х SSPE, содержащем 0,5% SDS, 100 мкг на мл денатурированной ДНК телячьего тимуса и 10 х раствора benhardt. На этой стадии прибавляют свежую аликвоту гибридизирован- ного раствора вместе с приблизительно 108 отсчетов в минуту радиоактивного зонда гена дрожжевой АЛС. Гибридизацию проводят в течение 24-48 ч при 56°С. В этот момент фильтры вначале промывают в течение приблизительно 4ч в6х55РЕпри56°С, затем промывают еще трижды в течение 20 мин каждый раз в 2 х SSPE при температуре около 23°С. Затем фильтры сушат и подвергают воздействию ретгеновской пленки Kodak XAR и усиливающего экрана Du Pont Cronex®Lightning Plus™ при -70°С в течение 2 дней. Открытые места на пленке указывают положение пятен, потенциально содержащих гены АЛС Nicotiana.

Полученные авторадиограммы затем Ориентируют над первоначальными, бакте- риофагсодержащими чашками Петри. С использованием широкого конца стерильной пастеровской пипетки вырезают пятна, соответствующие наиболее темным местам на авторадиограммах. Собранные пятна затем элюируют в буфер SM и высевают на свежие чашки Петри диаметром 90 мм. Каждая чаш- .ка получает около 100-200 фагов. Затем повторяют полный процесс определения местоположения фагов, используя вновь приготовленный зонд. Таким образом повторяют стадии определения местоположения и выделения фагов до тех пор, пока большинство пятен не покажет присутствие фага, содержащего ДНК, способную гибридиэировэться к зонду гена АЛС дрожжей.

Выделяют мини-препараты ДНК из очищенного от пятен фага, обозначенного Nt А13. Продукты переваривания мини-препаратов ДНК с помощью рестрикционной эн- донуклеазы EcoRI подвергают электрофорезу через 0,7% агзрозные гели и блоттингу на нитроцеллюлозных фильтрах. Фрагменты, содержащие ген АЛС, затем идентифицируют путем гибридизации с зондом дрожжевого АЛС-гена. Фрагменты, способные гибридизироваться е зондом, затем выделяют и субклонируют в векторы pBR322,

M13mp9 или M13mp18. Эти фрагменты далее секвенируют с использованием олигонуклео- тидных праймеров методом дидезокси-тер- минирования цепи. Используют комплект приборов, поставляемый New England Blolabs. Использование синтетических олиго- нуклеотидных праймеров позволяет осуществить растяжение ДНК-последовательности вдоль клонированного фрагмента в перекрывающихся сегментах. С помощью ЭВМ-анализа последовательности ДНК идентифицируют открытую рамку считывания 667 кодов. Выведенная аминокислотная последовательность этой открытой рамки считывания в основном гомологична последовательностям, ранее определенным из гена ILV2 Saccharomyces cerevislae и гена HvG E.colf, что указывает на то, что фрагмент ДНК, восстановленный из геномной библиотеки Nfcotiana, содержит ген АЛС табака. Для того, чтобы определить, кодирует ли этот ген АЛС гербицидчувствительный энзим дикого типа или мутантный гербицидустойчивый энзим из линии 54, ген вводят в гербицид- чувствительный табак дикого типа путем трансформации, опосредственной Agrobac- ferlum tumefacfens,

. Требуется генетический маркер для отбора трансформированных растительных клеток. Используют устойчивость к антибиотику G-418, получаемую в результате того, что бактериальный ген NPT 11, кодирующий неомицинфосфотрансферазу. экспрессиру- ется в растениях. Для осуществления экспрессии NPT 11 регуляторные последовательности растений синтезируют с участком кодирования NPT 1.1 в векторе pKNK. Вектор pKNK происходит от часто используемой плазмиды pBR322 в результате отщепления сайтов Hind III и Bam Ht и вставки в сайт Cla I фрагмента Cla I (приблизительно, 2,3 кб), который состоит из следующих компонентов:

а) последовательность Cla l-Bgl И длиной 320 пн, содержащая промоторный участок гена неомицинфосфотрансферазы (NRT II) транспозона Тп 5, происходящего в результате преобразования сайта Hind 111 в сайт Cla I;

б) последовательность SaU 3A-Pst I длиной 296 пн, содержащая промотор нопалинсинтазы (NOSP), происходящий от гена нопалинсинтазы (NOS) (нуклеотиды -263 до +33), относительно сайта начала транскрипции, путем создания сайта Pst I кодона инициации;

в) последоватеьнрсть Hind UI-Bam Hf длиной 998 пн, содержащая кодирующую последовательность для гена NRT 11. происходящего от Тп 5, путем создания сайтов

Hind lit и BamH I у нуклёотидов 1540 и 2518, соответственно;

г) последовательность BamH -1-Cla I длиной 702 пн, содержащая З1 -участок гена 5 нопалинсинтазы (нуклеотиды 848-1550).

Нуклёотидная последовательность у слияния NOSP и кодирующей последовательности NPT И выглядит следующим Образом: последовательность NOS

10 последовательность NPT If ... ...

AATAATCTGCAGCAAGCTTGCGGGGA TCGTTCGC ATG ... ...

Pstl Hind III

Вектор pKNK расщепляют рестрикцион5 ным энзимом Sal I (BRL), полученный линейный вектор после экстракции фенолом соединяют в присутствии ДНК-лигазы Т4 с очищенным фрагментом Sal I (2,1 кб), несущим бактериальный ген неомицинфосфот0 рансферазы I (NPT I) в качестве селектируемого маркера для бактериальной устойчивости к канамицину. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток НВ101 Е.соН, и трансформанты се5 лектируют на чашках, содержащих 100 мг/л канамицина. Полученную рекомбинантную плазмиду, обозначенную pKNKS, подвергают очистке.

Плазмиду pKNKS расщепляют рестрйк0 ционным энзимом Ёсо Rl (BRL) и ее концы затупляют фрагментом Кленова (BRL|. Полученную линейную ДНК соединяют в присутствии ДНК-лигазы Т4 (New England Blolabs) с фосфорилированными линкерами

5 Bgl II. Вслед за экстенсивным перевариванием рестрикционным энзимом Bgl II (BRL) для удаления избыточных линкеров ДНК пропускают через колонку гель-фильтрации Сефадекс G-150 (очищенный) с тем, чтобы

0 отделить ее от линкеров. Фрагмент ДНК выделяют и обьем регулируют с получением концентрации ДНК около 78 мкг/мл. 1 мкл ДНК еамолигируют в присутствии ДНК-лигазы Т4 в общем объеме 5 мкл и используют

5 для трансформации компетентных клеток 1 НВ101 E.coli. АмпицИллинустойчивые клетки содержат плазмиду pKNKSG, которая идентична плаэмиде pKNKS за исключением того, что рестрикционный сайт EcoRl за0 мещен сайтом Bgl II..

Фрагмент Sma I фага №А13 содержит . участок, который гибридизируется к дрожжевому гену АЛС. Фаг NtA13 частично переваривают рестрикционным энзимом Sma I и

5 вслед за экстракцией фенолом присоединяют к фосфорилированным линкерам BamH I в присутствии ДНК-лигазы Т4. После гидролиза BamH J и удаления избыточных линкеров путем электрофореза на агарсзном геле рестрикционный фрагмент BamH I (16 кб).

содержащий АЛС-ген табака от фага NtA13, выделяют из геля электроэлюированием и используют для дальнейшего клонирова- ния.

Вектор pKNKSG линеаризуют рестрик- ционным энзимом Bgl II (BRL) и вслед за дефосфррилированием кишечной фосфата- зой теленка его присоединяют в присутствии ДНК-лигазы Т4 к рестрикционному фрагменту (16 кб) ВатН 1, происходящему из фага NtAtS. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток ИВ 101 Е.соН и отбирают ампициллинустой- чивые трансформанты, которые содержат рекомбинантную плазмиду, обозначенную plV13. Ориентация фрагмента-вставки в p)V13 такова, что рамки считывания гена NOS:NPTII в векторе и гена АЛС во вставке находятся в противоположных направлениях. После очистки тремя штриховыми разводками одной колонии НВ101 (plV13) используют для трехродительского скрещивания. 3 мл ночных культур НВ101 E.colt (P.1V13) и НВ101 Е.соН (pRK2013) (номер АТСС 37159) в среде LB, содержащй 25 мг/л канамицина, выращивают при 37°С, а GV3850 Agrobacterlum tumefaclehs - в среде LB при 28-29°С. Клетки собирают при ком-, натной температуре в клинической центрифуге, промывают один раз в стэеде LB, не содержащей лекарства, собирают и ресус- пендируют в 3 мл LB, 0,25 мл аликвоты всех трех штаммов смешивают в пробирке и смесь переносят на миллипоровый фильтр (2,5см HAWP, 0,45 мкм), помещенный на поверхности трех фильтров из ватманской бумаги № 1 в чашке Петри. После того, как вся жидкая среда абсорбирована ватманским фильтром (около 30 мин), миллипоровый фильтр с бактериями на его верхней поверхности кладут (сторона с бактериями показывает наверх) на чашку со средой LB без лекарства. После инкубирования в течение ночи при 28-29°С миллипоровый фильтр переносят к 5 мл 10 мМ раствора MgS04 и завихряют с тем/чтобы ресуспен- дировать бактерии в растворе. 0,1 мл алик- воты высевают на чашки с селективной средой чашки с минимальной средой М9, содержащей 20% сахарозу, 1 мМ MgSO/i. 1 мМ CaCte и 1 мг/мл канамицина (Sigma). Через примерно 4 дня инкубирования при 28-29°С проявляются несколько больших колоний. Очищают несколько трансконъю- гантов тремя последовательными штриховым разводками (одноколониевыми) на тех же селективных чашках. Ожидают рост только Agrobacterlum, содержащих плазмиду plV13, вновь объединенную с эндогенной плазмидой pGV3850 за счет их общих последовательностей pBR322. Это подтвердилось анализом Southern перед использованием изготовленной Agrobacterium, GVKNT13 для трансформаций растений.

Для трансформации растительных клеток следуют стандартным асептическим методикам для манипуляции стерильными средами и аксенными растительно-бактериальными культурами, включая.использова0 ние колпака с ламинарными потоками для всех переносов. Составы сред представлены в примере 6, Консервированные растения табака для заражения листовых пластин выращивают в растильне: 12 ч при дневной

5 температуре 24°С и 12 ч при ночной температуре 20°С, относительной влажности около 80%, смешанном свете флуоресцентного и накаленного свечения. Осуществляют заражение листовых пластин табака.

0 Молодые листья, не полностью распустившиеся и имеющие приблизительно 4-6 дюймов (101,6-152Ямгм) в длину, собирают скальпелем с растений табака (Nicotlana tabacum, разновидность Xanthl) приблизи5 тельно 4-6-недельного возраста. Листья поверхностно стерилизуют в течение 30 мин погружением их в около 500 мл 10%-го Chlorox, 0,1%-го раствора додецилсульфата натрия и затем промывают 3 раза стериль0 ной деионизированной водой. Листовые пластины диаметром 6 мм получают из целых листьев с помощью стерильного бумажного пуансона.

Листовые пластины инокулируют погру5 жением их в течение нескольких минут в 20 мл ночной культуры (разбавление 1:10) Agrobacterium, несущей плазмиду GCKNT13. Выращивание культуры Agrobacterlum начинают инокулированием 10 мл бульона YEB

0 единственной бактериальной колонией, удаленной из чашки со средой R-arapa. Культуру выращивают приблизительно 17-20 ч в 18 мл стеклянных пробирках с культурой в качалке с платформой New Brunswick, под5 держивая температуру 28°С.

После икокулирования листовые пластины помещают на чашки Петри, содержащие среду агара CN. Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют при смешанных

0 флуоресцентном и Cro and Sho освещениях для растений в течение 2-3 дней в камере для выращивания культур, где поддерживается температура около 25°С.

Чтобы избавиться от листовых пластин

5 Agrobacterlum и отобрать для выращивания трансформированных клеток табака, листовые пластины переносят на свежую CN-cpe- ду, содержащую 500 мг/л цефотаксима и 100 мг/л канамицина. Цефотаксим сохраняют в виде замороженного 100 мг/мл основного раствора и прибавляют асептически (стерилизуют через 0,45-микрометровый фильтр) к средам после автоклавирования. . Свежий раствор канамицина (50 мг/мл) приготавливают для каждого использования и стерилизуют через фильтр, пропуская его в аетоклавированные среды.

Листовые пластины инкубируют в описанных условиях в течение 3 недель и затем переносят на свежие среды такого же состава.

Приблизительно через 1-2 недели всходы, развивающиеся на среде, содержащей кзнэмицин, подрезают стерильным скальпелем и высевают в среде А, содержащей либо 100 ч. на млрд. хлорсульфурона, либо 100 мг/л канамицина. До истечения 3 недель регистрируют корнеобразование на селективной и неселективной средах.

В течение 2 недель посева удаляют маленькие листья с подрезанных проростков для определения уровней устойчивости к хлорсульфурону и канамицину в проводимом испытании на каллюсовую индукцию на селективных средах. Для индуцирована образования кал л юс а отрезают маленькие листья/ которые разрезают, на несколько участков с помощью скальпеля и засевают в В-среду, содержащую либо 10 ч. на млрд. хлорсульфурона, либо 50 мг/л канамицина. До истечения 3 недель регистрируют кэллю- совой рост на селективной или неселективной средах.

Приведенные в табл.1 результаты указывают На то, что трансформация табака была достигнута с помощью штамма CVKNT13 на основе получения канамицину- стойчивого каллюса. Канамицинустойчивый кал л юс остается чувствительным к сульфо- нилмочевинному гербициду хлорсульфурон. что означает, что ген АЛС, выделенный из мутанта S4 табака в фаге Nta 13, кодирует гербицидчувствительный энзим дикого типа. Этот ген АЛС растений использовался в качестве зонда гибридизации ДНК для выделения других растительных АЛС генов, включая гены, которые кодируют гербици- дустойчивую АЛС.

Геномную библиотеку ДНК из мутанта Нга табака конструируют в бактериофаге лямбда и подвергают скринингу на клоны, которые гибридизируются к гену АЛС табака дикого типа из мутанта S4. Выделяют несколько фаговых клонов. Физическое картирование ДНК-вставок табака с использованием рестрикционных зндонуклеаз выявляет присутствие двух различных классов фрагментов ДНК, представляющих два гена АЛС: SURA и SURB. Сравнение физических карт генов SURA и SURB N.tabacum

с картами от прародительских видов показывает, что ген SURA происходит от N.sylvectrls, а ген SURB происходит от N.tomentoslformis. Ген АЛС дикого типа, вы- 5 деленный ранее из мутанта S4. обозначают SURA. Генетическое сцепление гербициду- стойчивой мутации высокого уровня е Нга с мутацией S4 показывает, что мутация Нга наблюдается в том же гене АЛС. что и мута- 0 ция S4, а именно в SURB. Следовательно, ожидается, что ген SURB, выделенный из мутанта Нга, должен быть мутантным геном, обозначенным SURB-HRa и кодирующим гербицидустойчивую АЛС. Выбирают один

5 фаговый клон, содержащий ген SURB-Hra, для дальнейшего анализа. Этот фаговый клон, обозначенный 3, депонирован в Американской коллекции типовых культур, Рок- вилл, Мэрилэнд, под каталожным номером

0 АТСС 40237. фаговый клон переваривают рестрикционной эндонуклеазой Spe I с получением ДНК-фрагмента (8,3 кб), который вставляют в сайт ХЬа I плазмиды рМис19, и полученную рекомбинантную плазмиду

5 pAGS148 депонируют в Американской коллекции типовых культур, Рок вилл, Мэрилэнд, под каталожным номером АТСС 67124. Плазмиды pAGS148 и pAGS135 лиги- руют одну с другой, как описано ниже, и

0 полученную рекомбинантную плазмиду PAGS152 вставляют в LRA . 4404 Agrobacterium tumefacfens. Полученную LBA 4404 (pAGS152) Agrobacterium tumefaciens депонируют в Американской

5 коллекции типовых культур под каталожным номером АТСС 67126. .

Геномную библиотеку ДНК из мутанта СЗ табака конструируют в бактериофаге лямбда и подвергают скринингу на клоны,

0 которые гибридизируются с ранее выделенными генами АЛС из табака, несколько фаговых клонов выделяют, после чего ДНК-вставки табака физически картируют рестрикционными эндонуклеазами. Иден5 тифицируют два различных типа фрагментов ДНК, соответствующих гену SURA-C3 и гену SURB. Для дальнейшего анализа отбирают два фаговых клона, обозначенных 35 и 38 и несущих ген SURA-C3.

0 Фаговый клон 35 переваривают рестрикционными эндонуклеазами Spe I и Sal I с получением фрагмета ДНК (6,3 кб). Этот фрагмент ДНК вставляют в плазмидный вектор pUC119, переваренный рестрикционны5 ми эндонуклеазами ХЬА I и Sal I, и полученную рекомбинантную плазмиду pALS35 депонируют в АТСС, Роквилл, Мэрилэнд, под каталожным номером АТСС 67424.

Кроме четырех генов АЛС табака, а именно SURA и SURB. кодирующих гербицидчувствительные АЛС дикого типа, и SURA-C3 и SURB-Hra, кодирующих мутан- тную гербицидустойчивую АЛС, гены АЛС выделяют из Arabidopsls thaliana, Beta vulgaris (свекла сахарная) и часть гена АЛС выделяют из Zea mays (кукуруза). Последние гены АЛС из гербицидчувствительных растений получают из геномных библиотек ДНК, сконструированных в бактериофаге лямбда скринингом на ДНК, гибридизирую- щуюся с ранее выделенным геном АЛС из дрожжей или табака. Ген АЛС дикого типа из сахарной свеклы выделяют в фаге, обозначенном Ф21, и физически картируют ре- стрикционными эндонуклеазами. Плазмида pBALS216 депонирована в АТСС, Рок-вилл,- Мэрилэнд, под каталожным номером 67425. Гены, кодирующие гербицидустойчи- вые энзимы АЛС, выделены из спонтанных мутантов дрожжей, устойчивых к сульфо- нилмочевине. Секвенирование этих генов показывает, что молекулярную основу устойчивости составляют изменения в основных парах, приводящие к аминокислотным замещениям в 10 различных положениях в белке (табл.2), имено остатки 121, 122, 197, 205,256,359,384,588,591,595. - В шести из этих положений, а именно 122,197, 205,256,384 и 591 (табл.2), получают более чем одно з амещение.- придающёе гердицидную устойчивость. В положении 122 остаток аланина присутствует во всех известных энзимах АЛ С дикого типа за исключением изоэнзйма | E.coll, в котором остаток 122 замещен на аспарагиновую кислоту, пролин, треонин или валин, что приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 197. остаток пролина присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа за исключением изоэнзимов I и {II E.coll, замещение серина или аргинина приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 205, где остаток аланина присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа, замена остатка в положении 205 на аспарагиновую кислоту или треонин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 256, где остаток лизина присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа, замена остатка 255 на глутаминовую кислоту, аспарагин или треонин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 384, где аспарагиновая кислота присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа, замена остатка 384 на глутаминовую кислоту, аспарагин или валин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 591, где триптофан

присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа, за исключением изоэнзйма I E.coli, в котором замена 591 остатка на аланин, цйстеин, глицин, лейцин, аргинин

или серии приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине,

Были получены мутанты, устойчивые к гербицидам на основе сульфонилмочевины, в результате отдельных аминокислотных за0 мещений в других четырех положениях, а именно 121, 359, 588 и 595. В положении 121, где глицин присутствует во всех известных энзимах АЛС, замещение его сери- ном приводит к получению АЛ С, устойчивой

5 к сульфонилмочевине, В положении 359, где метионин присутствует во всех известных энзимах АЛС, замещение его валином приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 588, где

0 валин присутствует во всех известных энзимах АЛС, замещение его аланином приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 595, где фенилаланин присутствует во всех извест5 ных энзимах АЛС. за исключением изоэнзйма III E.coll, замещение его лейцином приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине.

Олигонуклеотиднаправленные сайтспе0 цифические мутации, приводящие к аминокислотным замещениям в положениях 122, 205, 256, 359, 384 и 5.91, выполнены в дрожжевом гене, кодирующем АЛ С (табл.3). В положении 122 производят мутации,

5 приводящие к замещениям аланина 18 аминокислотами, присутствующими в АЛС дико- со типа. Каждое замещение за исключением глицина приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положение

0 205 мутации, приводящие .к замещениям аланина - остатка дикого типа на цйстеин, глутаминовую кислоту, аргинин или трипто- фан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине. В положении 256 мутации,

5 приводящие к замещениям лизина - остатка дикого типа на аспарагиновую кислоту, глицин, лейцин, пролин или триптофан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине. В положении 384 мутации, приводящие к

0 аминокислотным замещениям аспарагино- вой кислоты - остатка дикого типа на цйстеин, глицин, пролин, лизин, серин или триптофан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине. В положении 591 мут а5 ции, приводящие к аминокислотным замещениям триптофана - остатка дикого типа на аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, фенилаланин, гмстидин, изолей- цин, лизин, аргинин, валин. метионин. аспарагин, глутамин, треонин или Тирозин,

171820914 18 образуют АЛ С, устойчивую к сульфонилмо- няются во всехтербицидчувствительных эн- чевине.зимах АЛС дикого типа, до сих пор имеющих

Все мутации, описанные в табл.2 и 3, отличительные признаки эукариотов, не.ко- E.coli приводят к получению энзимов, кото- торые замещения в этих положениях встре- рые активны и менее ингибируются герби- 5 чаются в бактериальных энзимах АЛС. цидэми на основе сульфонилмочевины, чем дикого типа. Изоэнзим I E.coli имеет серии, энзимы дикого типа. Вместе взятые эти ре а не аланин в положении 122, и глутамин, а зультаты показывают, что большинство за- нетриптофан в положении 591; изоэнзим II мещений в этих 10 положениях приводит к E.coli имеет серии, а не пролин в положении получению.ферментативно активной герби- 10 197, а изоэнзим III E.coli имеет аланин, а не цидустойчиврй АЛС,.. лролин в положении 197 и изолейцин, а не

Аминокислотные остатки в положениях фёнилаланин в положении 595. Каждый из 121, 122, 197, 205, 256, 359, 384, 588, 591 и этих изоэнзимов АЛС E.col более устойчив 595 во всех.растительных энзимах такие же, (от 50 раз до более чем 10 000 раз) к ингиби- кбторые присутствуют в гербицидчувстви- 15 рованию (определенными) сульфонилмоче- тельном дрожжевом белке дикого типа. Ока- винными гербицидами, чем растительная залось, что две мутации генетически связаны , или дрожжевая АЛС. Кроме того, сайт-на и введение этого фрагмента в чувствительные правленная мутация, вызывающая замеще- клетки табака придает клеткам такой же уро- ние серина пролином в положении 197 в вень гербицидной устойчивости, который об- 20 Е.соН.АЛС II, придает мутантному энзиму в наружен для первоначального высоко-. 100 раз большую чувствительность к инги- устойчивого мутантного растения табака, от бированию, т.е, такую чувствительность, ко- которого происходит данный энзим. На ос- торая присуща энзимам высших растений нове этих фактов ожидается, что должны дикого типа. Таким образом, пролин в поло- быть два аминокислотных замещения в эн- 25 жении 197 вовлечен в гербицидноесвязыва- зиме, кодируемом этим фрагментом. Срав- ние в АЛС К E.coli так же, как и в АЛС нение выведенной аминокислотной дрожжей и высших растений, последовательности мутантной АЛС с выве-Кроме того, были выполнены сайтнап- денной аминокислотной последовательно- равленные мутации,, которые приводят к за- стью АЛС дикого типа выявляет, что 30 мещениям триптофана лейцином и MyTaHfHafl АЛС имеет замещение пролина глутамина триптофаном в положе,нич 591 в аланином в положении 197 и замещение АЛС II и АЛС I соответственно. Мутация в триптофана лейцином ъ положении 591. На АЛС II придает энзиму больше устойчивости основании изложенного обнаружено, что к гербицидам, чем АЛС II дикого типа, тогда замещения в остатках пролина 197 и трип- 35 как мутация в АЛС I придает ему больше тофана 591 придают гербициднуюустойчи- чувствительности к гербициду, чем АЛС I вость. Сравнение выведенной аминокис- дикого типа.

лотной последовательности мутантного эн-Сайтнаправяенные мутации в положе- зима АЛ С с аминокислотной последователь- ниях 197 и 591 в АЛС I и АЛС И E.coli оказы- ностью энзима .АЛ С дикого типа выявляет, 40 вают. воздействие на ингибирование что мутантная АЛС имеет единственное за- мутантных энзимов гербицидом так, как мещение пролина глутамином в положении можно это предсказать из действия дрож- 197, Линия клеток СЗ, из которой был получен жевых и растительных белков АЛС гербици- reHSURA-СЗ. показывает избирательную гер- дустойчивых мутантов. Эти эксперимен- бицидную устойчивость. Это означает, что му- 45 тэльные данные лодеерждают универсаль- тация СЗ придает устойчивость к сульфонил- ность аминокислотных остатков, вовлечен- мочевинным гербицидам хлорсульфурон и . ных в гербицидное связывание с энзимами сульфоментуронметил, но не придает устой- АЛС из разнообразных источников, чивость к гербициду на основе имидазоли- нона. 50 Аминокислотные замещения, необходиИдентификация аминокислотных заме- мые для придания гербицидной устойчиво- . щений в гербицидустойчивых энзимах АЛС сти, получают путем сайтспецифического из растений в положениях 197 (от мутантов мутагена фрагмента нуклеиновых кислот, СЗ и Нга)и591 (от мутанта Нга) показывает, кодирующего гербицидчувствительную что замещения в положениях, операбель- 55 АЛС, следующим образом: ных в дрожжевой АЛС, также операбельны(1) выделяют геномную ДНК или мРНК в растительной АЛС.. из растения;

В то время как аминокислотные остат-(2) конструируют геномную библиотеку ки, присутствующие в положениях 121, 122, из выделенной ДНК или кДНК-библиотеку 197,205, 256.359.384, 588.591 и 595, сохра- из выделенной РНК;

(3) идентифицируют те фаги или плазми- ы, которые содержат фрагмент ДНК, кодиующий АЛ С;

(4) секвенируют фрагмент, кодирующий ЛС;5

(5) субклонируют фрагмент ДНК, несуий ген АЛС, в клонирующий носитель, коорый способен произвести однонитёвую НК;

(6) синтезируют олигонуклеотид длиной 10 около 15-20 нуклеотидов, который комплементарен определенной нуклеотидной последовательности АЛС, кодирующей одну из аминокислотных субпоследовательностей, за исключением нуклеотидного (-ных) 15 изменения (изменений), необходимого Для мутации;

(7) присоединяют олигонуклеотид к од- нонитевой ДНК, содержащей мутируемый участок, и используя его для первичного 20 синтеза In vitro нити комплементарной ДНК, образующей гетеродуплекс;

(8) трансформируют бактериальные клетки гетеродуплекснрй ДНК;

(9) осуществляют скринингтрансформи- 25 рованных бактериальных клеток для тех клеток, которые содержат мутированный фрагмент ДНК, путем а) иммобилизации ДНК на нитроцеллюлозном фильтре, б) гибридизации с 5( -концом, меченам Р, мута- генным олигонуклеотидом при температуре окружающей среды ив) промывки ее в условиях повышенной температуры с тем, чтобы избирательно отделить зонд от гена дикого типа, но не мутантнрго гена;

(10) выделяют фрагмент двунитевой ДНК, содержащей мутацию из клеток, несу- - .щих мутантный ген; и

(11) подтверждают присутствие мутации анализом последовательностей ДНКЪ 40

Получение гербицидустойчивых растений. .- .- .. . ; . ;.. . -.

Фрагменты нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут быть использованы для введения гербицидной устойчивости 45 в растения. С целью вставления фрагмента Нуклеиновых кислот, который включает ген, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, в различные растения, используют большое разнообразие методик в зависимости от же- 50 лаемого вида или культурного сорта. Вообще экспланты или протопласты могут быть .взяты или получены из.растений, выращенных либо In vitro, либо в почве. Экспланты или протопласты могут быть получены из 55 семядолей, стеблей, черешков, листьев, корней, незрелых зародышей, гипокотилий, соцветий и т.д. В теории любая ткань, которой можно манипулировать in vitro с образованием нового каллюса -или

30

35

0 5

0

5

0

5 0 5

0

5

организованного роста ткани, может быть использована для генетической трансформации,,

Для достижения трансформации эксплантаты или протопласты могут совместно культивироваться с Agrobacterlum, которую индуцируют для переноса фрагментов нуклеиновых кислот, расположенных между границами Т-ДНК плазмиды П, в растительные клетки. Другой способ, менее встречающийся на практике, заключается в прямом поглощении ДНК растительными протопластами.

В примерах целый ряд эксплантов из различных растений культивируют совместно с Agrobacterlum с тем,.чтобы достигнуть трансформации в гербицидную устойчивость. Эти экспланты культивируют так, чтобы позволить расти каллюсу. Затем каллюс сразу исследуют на устойчивость к сульфо- нилмочевинам или растения регенерируют, а затем исследуют на устойчивость к сульфо- нилмочевинам. Исследование заключается в ферментативном анализе экстрактов растительных клеток на наличие активности АЛС, устойчивой к гербициду, и/или в выращивании растительных клеток в культуре Или целых растений в присутствии обычно ингибирующих концентраций гербицида.

Фрагменты ДНК состоят из участка, кодирующего синтез гербицидустойчивой АЛС, и участка, предназначенного для экспрессии кодирующей последовательности « растениях. Фрагмент ДНК (8,3 кб), кодирующий белок гербицидустойчивой АЛС, состоит из приблизительно 800 п.н. в направлении 51 конца (по направлению вверх) кодирующего участка, достаточного для экспрессии белка в растениях. Этот фрагмент ДНК может придавать устойчивость к хлорсульфурону при концентрации последнего до 2000 частей на млрд. в трансформированных кал юсах табака. Растения, регенерированные из трансформированных клеток, также проявляют устойчивость на уровне целого растения. Фрагмент ДНК длиной 6,3 кб, который кодирует белок гербицидустойчивой АЛС, содержит 2,5 кб в направлении 5( конца (по направлению вверх) и 1.8 кб в направлении З1 -конца (по направлению вниз) кодирующего участка, достаточного для экспрессии белка в растениях. Этот фрагмент ДНК может придавать устойчивость к хлорсульфурону при концентрации последнего 2 частей на млрд, в трансформированных каллюсэх табака.

В работе, которая продолжается, фрагменты ДНК, содержащие сайтнзправлен- ные мутации в гене SURA, который, как ожидают, кодирует гербицидустойчивую

АЛ С, были выполнены заявителем. Эти мутации приводят к получению следущих аминокислотных замещений: Ala 122 на Ser, который как известно, операбелен в изоэн- зиме II АЛ С Е.соМ и дрожжевой АЛ С. Ala 122 на Val. который, как известно, операбелен в изоэнзиме II АЛ С E.coll и дрожжевой АЛС, Ala 122 на Pro, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, Pro 197 на Ser, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС и в изоэнзиме II АЛС E.coll, Pro 197 на Ala, который, как известно, операбелен в АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака, Lys 256 на Gfu, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, Asp 384 на Val, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, и Тгр 591 на Leu, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС и АЛС, кодируемой геном SURB-HRa табака. Путем объединения вышеприведенных мутаций также были выполнены двойные мутации, приводящие к получению двух аминокислотных замещений, таких как Ala 122 на Ser и Pro 197 на Ser, или Ala 122 на Ser и Pro 197 на Ala, или Pro 197 на Ala и Тгр 591 на Leu, или Pro 197 на Ser и Тгр 591 на L eu, Эти мутации были выполнены во фрагменте ДНК, содержащем примерно только 180п.н. в направлении 51-конца (по направлению вверх) и только около 600 п.н. в направлении 3 -конца (по направлению вниз) последовательности, кодирующей АЛС. Эти Фрагменты ДНК были вставлены в табак посредством трансформации. Гербицидная устойчивость не была экспрессировэна в этих трансформантах. Полагают, что использование регуляторных последовательностей, найденных достаточными для экспресии гербицидной устойчивости с участком, кодирующим мутант SURA-C3, а именно 2,5 кб а направлении 5 -конца (по направлению вверх) и 1,8 кб в направлении 3 -конца (по направлению вниз) кодирующего участка, привело бы к экспрессии гербицидной устойчивости со всеми сайтнаправленными мутациями в участке, кодирующем SURA.

Сайтнаправленные мутации, которые, как ожидают, кодируют гербицидустойчи- вую АЛС, были выполнены также в гене АДС свеклы сахарной. Эти мутации приводят к получению следующих аминокислотных замещений: Ala 122 на Pro, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, Pro 197 на Ala, который, как известно, операбелен в АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака, Тгр 591 на Leu. который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС и в АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака и двойного мутанта, Pro 197 на Ala и Тгр 591 на Leu,

который, как известно, операбелен в АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака.

Предпочтительный способ встраивания фрагмента нуклеиновых кислот в раститель- 5 ные клетки заключается в использовании Agrobacterlum tumefaclens, содержащей фрагмент нуклеиновых кислот между грани- цамиТ-ДНК либо на бесплечевой плазмиде TJ (т.е. плазмиде Ti, из которой удалены гены

0 для иммуногенности опухолевых клеток), либо в бинарном векторе in trans в плазми- ду Т с Vir-функциями. Agrobactertum можно использовать для трансформации растений инокулированием тканевых эксплантатов,

5 таких как стебли или листовые пластины, или совместным культивированием с растительными протопластами. Другой предпочтительный способ встраивания фрагмента нуклеиновых кислот настоящего изобрете0 ния заключается в непосредственном введении фрагмента или вектора, содержащего фрагмент, в растительные протопласты или клетки с помощью или без помощи электро- порирования, полиэтиленгликоля или дру5 гих агентов или способов, известных для изменения пропускающей способности мембраны к макромолекулам.

Фрагменты нуклеиновых кислот настоящего изобретения можно использовать

0 для трансформации протопластов или клеточных культур из широкого спектра РИДОВ высших растений для образования культур растительных тканей настоящего изобретения. Эти виды включают двухдольные расте5 ния табак, петунья, хлопчатник, свекла сахарная, картофель, томат, салат-латук, дыня, подсолнечник, соя культурная, canola (рапс) и другие виды Brassica и тополя; и однодольные растения (кукуруза, пшеница,

0 рис, Lolium multiflorum и Asparagus offlclnalis). Ожидается, что все линии растительных клеток, имеющие протопластное происхождение, могут стабильно трансформироваться фрагментами настоящего изо5 бретения.

Фрагменты нуклеиновых кислот насто- ящего изобретения можно также вставлять -, в растительные клетки с последующим образованием трансформированных растений

0 настоящего изобретения. Трансформация целых растений осуществляется в растениях, клетки которых могут быть трансформированы инородными генами на стадии, на которой могут быть регенерированы целые

5 растения. В соответствии с настоящим изобретением трансформируемые растения являются однодольными и двудольными растениями. Предпочтительно, если трансформируемые растения выбирают из группы, состоящей из табака, петуньи.

хлопчатника, свеклы сахарной, картофеля, томата, салата-латука, подсолнечника, сои культурной, canola и других видов Brassica, тополей, люцерны, клевера, сахарного тростника, ячменя, овса и проса. Наиболее предпочтительно, если трансформируемые растения выбирают из группы, состоящей из табака, петуньи, картофеля, томата, подсолнечника, свеклы сахарной, люцерны, салата-латука или видов Brassica.

Можно дополнительно повысить уровень экспрессии фрагментов нуклеиновых кислот путем замещения их первоначальных регуляторных нуклеотидных последовательностей и 51 - и З1 -концов АЛ С-кодиру- ющей последовательности синтетическими или природными последовательностями, обеспечивающим экспрессию высокого уровня и/или тканьспецифичную экспрессию. Можно также заместить нуклеотидные последовательности фрагментов нуклеиновых кислот настоящего изобретения другими синтетическими или природными последовательностями, которые кодируют транзитные пептиды, способствующие эффективному хлоропластному поглощению фрагментов нуклеиновых кислот настоящего изобретения.

Способ иллюстрируется следующими примерами. ....

П р и м е,р 1. Выделяют ДНК табака (Nicotlana tabacum сорта Xanthl) из мутанта HVa. Отщепляют листы 2x13 г размером 2.54-5,08 см (1-2 дю,йма) от растений и сразу же разминают в 2 объемах по 20 мл буфера А (10 ММ трицин-КОН, рН 7.6-1,14 М сахарозы - 5 мМ MgClz - 5 мМ 2-меркапто- этанол) в холодной комнате с помощью ступок и пестиков. Прибавляют добавочное количество 40-50 мл буфера А, полученные суспензии фильтруют через 16 слоев марли. Фильтрат центрифугируют в роторе типа Son/all GSA при скорости вращения 2500 об/мин и температуре 4°С в течение 5 мин. Осадок после центрифугирования ресус- пендируют в 10 мл буфера А, примешивают еще 100 мл буфера А и клетки центрифуги руют при указанных условиях. Полученные гранулы затем ресуспендируют в 100 мл буфера А в смеси с 0,4%-ным раствором Тритона Х-100, выдерживают на льду в течение 10 мин и центрифугируют указанным образом. Гранулы после центрифугирования дважды промывают в последнем буферном растворе. Полученные конечные гранулы ресуспендируют в 5 мл рёсуспензионного буфера (50 мМ трис-HCt, рН 8,20 мМ ЭДТК), прибавляют 1 мл рёсуспензионного буфера, содержащего 10% саркозила, а затем объем доводят до 10 мл посредством рёсуспензионного буфера. Прибавляют протеиназу К до концентрации 100 мкг/мл до получения лизэтов, пизаты -подвергают перевариванию при 37°С в течение ночи. Лизаты затем

доводят до плотности 1,55 г/мл CsCI и до конечной концентрации 300 мкг/мл бромида этидиуса. Растворы центрифугируют в роторе типа Beckman TI 70.1 при скорости вращения 40 000 об/мин при 15°С в течение

0 24 ч, полосу флуоресцентной ДНК снимают после визуализации длинноволновым УФ- излучением. Для снятия ДНК в боковых сте нах трубок полиалломера прокалывают отверстия иглой калибра 18, что дает воз5 можность вязкой ДНК капать каплями в трубку для сбора материала. Для предотвращения среза ДНК на всех стадиях после лизиса клеток соблюдают большую осторожность. ДНК вновь ресуспендируют в

0 мягких условиях в растворе CsCI с плотностью 1,55 г/мл и бромида этидиума с концентрацией 300 мкг/мл. а затем центрифугируют в роторе типа Sarvall TFT65.13 при скорости вращения 40. 000

5 об/мин и при 15°С в течение 48 ч. Затем ДНК вновь собирают через боковой прокол трубки-сборника. Затем ее экстрагируют 10 раз в мягких условиях посредством изоами- лового спирта, насыщенного ТЕ-буфером

0 (10 мМ трис-HCI, рН 8,1 мМ ЭДТК), а затем

экстенсивно диализу ют против ТЕ-буфера.

Конструируют библиотеку ДНК табака.

ДНК табака гидролизуют рестрикционным

энзимом Sau ЗА с образованием большин5 ства фрагментов, как определено электрофорезом в агарозном геле, протяженностью в интервалов 20 кб. (т.п.о). Полученные фрагменты нагружают на градиенты 10-40% сахарозы (в 1 М NaCi, 20 мМ трис, рН 8, 1 мМ

0 ЭДТК)и фракционируют по размерам центрифугированием в роторе типа Bekman SW 28 при скорости вращения 26000 об/мин и при 17°С в течение 16ч. Фракции, образованные от градиентов концентрации сахаро5 зы, собирают и анализируют электрофорезом в агарозном.геле, причем фракции, содержащие фрагменты размером 20 кб (20 Т.П.О.). диализируют против ТЕ-буфера и осаждают этанолом. Затем указанные фрак0 ции лигируют с плечами EMBL3 фага лямбда, расщепленными ВаглН (при молярном соотношении 2:1, и упаковывают в головки фага лямбда, следуя инструкциям изготовителя по плечам генома лямбда и реакциям

5 упаковки.

Библиотеку ДНК табака, содержащую 400 000 фагов, высевают в чашки со штаммом-хозяином Е.соН LE 392 при плотности 50 000 фагов на 150 мм чашку Петри с распределением на 10 чашках. Осуществляют

перенос из бляшек фага на сдвоенные нит- роцеллюлозные фильтры и затем гибриди- зируют с зондами, меченными Р и несущими либо 51 -/шбо З1 -фрагменты гена АЛС, полученные в системе мечения рибо- зондов. Бляшки, дающие положительные сигналы на пленках из обоих комплектов фильтров, собирают и очистку повторяют многократно до тех пор, пока не получат хорошо изолированные гибридизирующие- ся бляшки.

Анализируют минипродукты ДНК из очищенного фага обработкой рестрикцион- ным энзимом. Различают два класса вставок фрагментов клонированной ДНК табака. Фаги 1, 2, 17 и 18 содержат вставки, родственные с ранее выделенным геном АЛС из места SURA, кодирующего чувствительную к гербициду АЛС. Фаг 3 содержит вставку, отличающуюся от указанной, которая, как предполагают, содержит ген SURB- Нга, кодирующий АЛС, устойчивую к гербициду. Фрагменты EcoR l, которые окружают участки гибридизации фага 3, суб- клонируют в фаговые векторы М13 и . проводят анализ последовательности ДНК, Используя олигонуклеотиды для расширения секвенированных участков в перекрывающихся сегментах. Обнаружена единственная открытая рамка считывания из 1992 нуклеотидов, которая идентифицирована как ген АЛС путем сравнения выве- денной аминокислотной последовательности с консервативными участками аминокислотных последовательностей белков АЛ С других видов.

АЛС-гены, изолированные из гербици- дустойчивогомутантного табака Нга, вводят в чувствительные клетки табака через систему бинарный вектор, используя Agrobac- terium tumefacfens. гены АЛС первоначально вводят в бинарный вектор в A.tumefa- clens через конъюгацию плазмиды и затем используют сконструированную A.tumefaciens для трансформации растительных клеток чужеродными генами путем совместного культивирования.

А). Введение изолированных генов АЛС табака в A.tumefaciens

1). Очищенный фрагмент нуклеиновых кислот Spe Г размером 8,3 кб настоящего изобретения, изолированный из мутанта HVa табака и содержащий кодирующую последовательность для гербицидустойчивой формы гена АЛС, вставляют в сайт Хоа I плазмидного .вектора рМис19. Хотя ре- стрикционные энзимы Spe I и ХЬа I распознают отличающиеся ДНК-последовательности, продукты этого гидролиза носят аналогичную, выступающую на 5- -конце последовательность. Ориентацию вставляемого фрагмента в одной из результирующих плазмид pAGS148 определяют за счет анализов с помощью рестрикционного энзима. 5Бинарный вектор pAGS 135 используют для переноса плазмиды pAGS148 в А-tumefaciens. Плазмида PAGS135 происходит из плазмиды pAGS112. Она получена в результате переваривания ДНК плаэмиды

0 pAGS112 рестрикцией ной эндонуклеазой Xho I, обработки фрагментом Кленова пол- имеразы I ДНК E.coli и самолигэции ДНК, за счет чего осуществляется удаление сайта Xho вне правого предела Т-ДН К. Плазмидэ

5 pAGS112 происходит от вектора pLAFR с широким диапазоном хозяев. Она получена путем встраивания ее в pLAFR фрагмент EcoR 1, в котором пределы Т-ДН К ограничиваются геном для экспрессии устойчивости

0 к канамицину в растениях и уникальным сайтом ВатН I для клонирования. Плазмиды pAGS148 и pAGS135, очищаемые CsCI. переваривают ВатН I и образующиеся ВатН I - расщепленные плазмиды саязыва5 ют. Гибридную ДНК вводят в фаг лямбда in vitro и используют для заражения штамма НВ101 Escherichia coli. Трансформанты выбирают на ампициллине.

2). Конъюгация плазмиды pAGS152 из

0 E.coli в A.tumefaciens.

Плазмиду pAGS152 вставляют в tumefaciens путем конъюгации. Штамм НВ101 E.coli, содержащий плазмиду pAGS152, и штамм НВ101 E.coli, содержа5 щий мобилизирующий вектор pRK2013 (АТСС 37159), смешивают с штаммом LBA4404 A.tumefaciens. содержащим плазмиду , и подвергают скрещиванию на твердой LB-среде при 28°С в течение 16

0 ч. Трансконъюгаты селектируют на пластинах, содержащих рифампицин при концентрации 100 мг/л и тетрациклин при 1 мл/л. A.tumefaciens LBA4404 : pAGS152 подвергают рестрикции на минимальной А-среде, со5 держащей тетрациклин при 1 мг/л.

В основном аналогичный метод используют для .получения как штамма LDA4404 A.tuiTiefaciens, содержащего плазмиду pAGS112, причем бинаирный вектор не со0 держит какой-либо вставки фрагмента нуклеиновых кислот, так и штамма LBA4404 A.tumefaciens, содержащего плазмиду pAGS145, причем бинарный вектор содержит фрагмент нуклеиновых кислот от фаго5 вогр клона 1. Последний фрагмент также изолируют из мутанта Нга растений табака и он несет ген для экспрессии гербицидчув- ствительной формы АЛС, этот ген не является аллелем дикого типа гена для экспрессии гербицидчувствительной АЛС. а представяет собой ген SURA из второго генетичекого локуса.

В). Введение изолированных генов АЛС чувствительные клетки табака посредст- 5 ом совместного культивирования клеток расений с штаммами LBA4404 A.tumefaelens pAGS145) и LBA4404 (PAGS152).

Все манипуляции на стерильных средах растительных материалах проводят в кол- 10 паках с ламинарным потоком в приемлемых мкостях. Выращивание растений и культивирование растительных клеток проводят при 27°С. Все манипуляции на протоплатах осуществляют при комнатной темпера- 15 уре, если не указано по-другому.

1 день (после полудня).

Приготавливает среду для изоляции . протопластов путем прибавления следующих компонентов к K3/S (I) - среде: 0,1% 20 (мас./об.)МЕ5-буфера(51дта Chemical Co.), 1% (мае./об.) целлюлазы (Onozuka или цел- люлизин)и 0,1% мацеразы (Onozuka). После осторожного перемешивания примерно в течение 30 мин значение рН доводят до 5,6 25 с помощью КОН и полученную среду стерилизуют на фильтрах.

Стерильные растения табака (Nlcotlana tabacum сорта Вискрнсин-38) культивируют из 1 см апикальных или вспомогательных 30 эксплантатов на OMS-среде в коробках типа Магента при цикле из 16-часового светлого периода (6000-8000 люкс) с последующим 8-часовым темным периодом. Когда растения достигнут 5-7 недельного возраста, от- 35 щеп ля ют полностью распустившиеся листья (3-6 листьев снизу от верхушки) и каждые два листа помещают верхней поверхностью вниз на 20 мл среды для изоляции протопласта, содержащейся в чашке Петри 40 размером 100 х 250 мм. Затем листья погружают в среду и мелко измельчают острым хирургическим скальпелем. Среднюю жилку листа фиксируют и надрезы делают наружу от нее в направлении к краю листа с проме- 45 жутками примерно 2 мм. После этого чашки Петри герметизируют парапленкой и маце- рированную ткань инкубируют в течение ночи (14-17 ч) в темноте при 27-29°С при осторожном встряхивании в роторе (20-25 50 об/мин). .

2 день (утро).

Воронку для фильтрования емкостью 75 мл, заполненную 4 слоями марли, закрепляют в кольцевидном держателе. Стеклянную 55 пробирку (длиной примерно 15 см и внешним диаметром 5 мм) прикрепляют к воронке с системой трубок из латекса. Используемую воронку, марлю, систему трубок и пробирок из стекла и латекса заворачивают в алюминиевую фольгу и стерилизуют в автоклаве в виде единого целого.

Систему стеклянных пробирок помещают в колбу Бабкока, а марлю пропитывают средой КЗ/5(1). Переваренную ткань листа с двух чашек Петри осторожно выливают в, воронку. Марлю промывают и выжимают в указанную колбу. Заполненные колбы доверху заливают средой K3/S(1), покрывают фольгой и центрифугируют примерно при ТОО х g в течение 10 мин. Плавающие протопласты (1-2 мл) собирают серологической пипеткой (1 мл) и помещают в 20 мл среды K3/S(1), содержащейся в другой колбе Бабкока. После ресуспендирования протопластов за счет осторожного перемешивания колбы Бабкока заполняют доверху и центрифугируют, как указано ранее.,Плавающие протопласты (1-2 мл) собирают по описанному методу и помещают в 30 мл среды K3/G(I). Указанные протопласты подсчитывают в гемацитомере, а полученный объем регулируют для получения 1-х протопластов на мл. 5 мл аликвот протопластов высевают в чашки Петри тканекультивиру- емые чашки Петри размером 100 х 20 мм (Corning) эти чашки используют во всех последующих манипуляциях с протопластами и выращивают в темноте.

2 день (после полудня)

Единую колонию клеток A.tumefaelens, содержащую вектор трансформации требуемого растения, а именно pAGS 112 (указанный плазмидный вектор), pAGS152 (содержащий фрагмент нуклеиновых кислот настоящего изобретения) или pAGS145 (содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую чувствительную форму АЛС); выращиваемую на пластине Минимал А, икокулируют в 5 мл среды Минимал А в 18 мм тестируемой пробирки и выращивают в течение ночи в роликовом барабане при скорости вращения 40-60 об/мин при 27-28°С.

3 день (утро)

Оптическую плотность культур A.tumefaelens измеряют при 550 км, доводят до 0,15 с помощью среды Минимал А и бактерии продолжают выращивать, как указано выше.

3 день (после полудня)

Когда оптическая плотность (при 550. нм) культур A.tumefaelens составляет 0.6 (логарифмическая фаза культуры), примерно через б ч после разбавления указанные бактерии вносят в клетки при титре примерно 50 бактерий/растительную клетку (оптическая плотность порядка 1 при 550 нм 1,4 х х 109 бактерий). Полученную смесь бактерий и растительных клеток совместно культивируют в течение 66 ч при 24°С при слабом

освещении (примерно 500 люкс). Нетрансформированные протопласты-контроли инкубируют аналогичным образом, но без использования агробактерий. Для каждого совместного культивирования проводят последующее протоколирование (для клеток, трансформированных различными агробактериями, а также для нетрансформированных клеток).

6 день (утро)

Совместное культивирование прерывают путем прибавления 20 мл смеси в соотношении 1:1, состоящей из среды K3/G(2) и среды С, дополненной 500 мг/л цефотакси- ма (при отборе против агробактерий) к 5 мл смеси для совместного культивирования. Совместно выращенные клетки осторожно и тщательно ресуспендируют в новой среде путем смешивания серологической пипеткой (5 или 10 мл). Плотность клеток составляет 2 х 104 протопластных эквивалентов/мл (протопластные эквивалентные исходным протопластам при 100% выхода и выживаемости клеток), а осмолярность составляет 0,35 М. Три порции по 5 мл аликвот из каждой культуры распределяют в свежих чашках Петри.

С этого момента до тех пор, пока культивируемые клетки не внедряется в твердую среду, они растут при слабом освещении (500 - 1500 люкс) без движения и их переносят в различные среды в стерильных условиях. В указанные времена клетки из одной чашки переносят в неселективные среды, в то время как клетки с других двух чашек из каждой культуры переносят в селективные среды, содержащие либо 50 мг/л канамици- на или 2 нг/мл хлорсульфурона для отбора трансформированных растительных клеток. Для этих переносов клеток содержимое из каждой чашки собирают с помощью серологической пипетки (5 мл), помещают в ргз- дельные конические трубки центрифуги из полистирола (емкостью 15 мл) и центрифугируют примерно при 50 х g в течение 5-10 мин. Надосадочную жидкость удаляют пипеткой, не разрушая рыхлых гранул. Полученные гранулы из совместно выращиваемых клеток с каждой из чашек затем осторожно ресуспендируют в соответствующей свежей среде.

10 день

Клетки переносят в 5 мл среды С, которая в случае неселектируемых растительных клеток дополнена 500 мг/л цефотэксима. а в случае селектируемых клеток дополнена 500 мг/л цефотаксима и либо 50 мг/л кана- мицина, либо 2 нг/мл хлорсульфурона. Каждую из указанных культур возвращают в чашки Петри, из которых они были взяты. Таким образом, для осуществления обмена

в среде с минимальной потерей клеток, не все клетки должны быть гранулированы. 13 день

Неселектируемые клетки переносят в 20 5 мл смеси с соотношением 3:1. состоящей из среды С и среды MSP с добавкой 500 мг/л цефотаксима, и 5 мл аликвоты распределяют в свежей чашке Петри (при плотности 5 х х 103 протопластных эквивалентов/мл). Се0 лектируемые клетки ресуспендируют в 5 мл смеси (3:1), состоящей из среды С и среды MSP, дополненной 500 мг/л цефотаксима и 50 мг/л канамицина, либо 2 нг/мл хлорсульфурона и возвращают на первоначальные

5 чашки для последующего культивирования. 16-17 день

Клетки переносят в 5 мл смеси в соотношении 1:1, состоящей из среды С и среды MSP, дополненной 500 мг/л цефотаксима (в

0 случае неселектируемых .растительных клеток) или 500 мг/л цефотаксима и либо 50 мг/л канамицина, либо 2 нг/мл хлорсульфурона (в случае селектируемых клеток) и выращивают, как описано выше.

5 20 день

Неселектируемые клетки переносят в 25 мл смеси в соотношении 1:1, состоящей из среды С и среды MSP, и затем полученную смесь прибавляют в 25 мл смеси в соотно0 шении 1:1. состоящей из 2 объемов среды MSP и 1% (мас./рб.) раствора агарозы типа VII (температура 50°С). Полученную культуру быстро перемешивают серологической пипеткой (25 мл) с широким отверстием и

5 распределяют в 5 мл аликвот на свежие чашки Петри. Суспендированные микрокаллюсы в растворе агара осторожно и равномерно распределяют по чашкам взбалтыванием вручную. Чашки покрывают и оставляют под

0 колпаком в течение часа для затверждения перед тем, как их обернут в парапленку и перенесут в вегетационную камеру. Плотность клеток составляет примерно 5 х 102 протопластных эквивалентов/мл и осмоляр5 ность составляет 0,15 М. Внедрившиеся клет- ки подсчитывают примерно 10 дней спустя счетчиком для подсчета колоний.

Селектируемые клетки переносят в 20 мл смеси в соотношении 1:3, состоящей из среды

0 С и среды MSP, дополненной 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хлорсульфурона. 5 мл зликвот ресуспендированных культур (5 х 10+3протоп- яаетных эквивалентов/мл) распределяют по четырем свежим чашкам Петри на селектйруе5 мую культуру и выращивают, как указано выше. 23-24 дни

Каждую культуру селектируемых клеток объемом 5 мл разбавляют 7,5 мл среды MSP, дополненной 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хлорсульфурона в целях получения

плотности клеток 2 х 1043 протопластных эквивалентов/мл. Эту культуру с установленной плотностью смешивают с 12,5 мл среды в соотношении 1:1, состоящей из 2 объемов среды MSP и 1 % (мае./об.) раствора агэрозы типа VII (температура 50°С), дополненной 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хлорсульфурона. 5 мл аликвот перемешанных культур быстро распределяют с помощью широкогорлой серологической пипетки (25 мл) на свежие чашки Петри. Конечная плотность посева составляет 1 х 103 протопластных эквивалентов/мл, а осмоляр- ность культуры составляет0,1 М. Чашки отвер- ждают, как описано выше. Внедрившиеся клетки подсчитывают примерно 10 дней спустя счетчиком для подсчета колоний.

25 день «

От 10 до 12 индивидуальных трансформированных каллюсов/колоний собирают и переносят скальпелем № 11 в чашку Петри, содержащую среду MSP с использованием или без использования соответствующего селективного агента для регенерации растений, Каллюсы выращивают при 27°С с фотопериодом в 16 световых часов (5000 - 8000 люке) с последующими 8 ч темноты. Побеги появляются спустя 2-3 недели и продолжают свое развитие в течение нескольких месяцев. Побеги длиной 2-3 мм срезают острым хирургическим скальпелем и переносят для укоренения в среду OMS в ящики Магента. После образования корневой системы (1-4 недели) растения переносят в почву для регенерации.

Результаты совместного культивирования.

Полученные результаты вследствие экс- периметов по совместному культивированию показывают, что фрагмент нуклеиновых кислот настоящего изобретения, кроме гена SURA табака для экспрессии гербицидчув- ствительной формы АЛ С, придает устойчивость к гербициду, когда его вводят в гербицидчувствительные клетки табака (см. табл.4 и 5). Поскольку фрагмент нуклеиновых кислот настоящего изобретения может придать устойчивость к гербициду при аналогичной частоте, когда его вводят в любую ориентацию относительно вектора, он содержит регуляторные последовательности обоих 51 - и 3 -концов относительно кодирующей последовательности, которая необходима для экспрессии гербицидустойчивого гена АЛ С.

Уровень устойчивости к гербициду, придаваемый фрагментом нуклеиновых кислот настоящего изобретения, определяют путем посева 100 колоний каждой из трансформированных клеток pAGS152 N.taba- cum, устойчивых к хлорсульфурону при 2 ч. на млрд. и не совместно культивированных клеток дикого типа N.tabacum при различных концентрациях хлорсульфурона. Подсчитывают количество активно растущих колоний при различных концентрациях хлорсульфурона после 1 месяца (см.табл.6). В то время как колонии дикого типа чувствительны к хлорсульфурону при концентрации 2 ч. на млрд., колонии, получаемые из совместного культивирования с плазмидой PAGS152 A.turriefaclens, могут выдержать концентрации до 2000 ч. на млрд. Такой уровень устойчивости полученных трансформантов сравним с уровнем гербицидустойчивого мутанта Нга табака, из которого фрагмент нуклеиновых кислот настоящего изобретения изолирован, причем он примерно в 10 раз выше уровня гербицидустойчивого мутанта S4 табака (родитель Нга).

Использование: генетическая инженерия, в частности получение фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактат- ринтетазу, устойчивую к гербициду. Сущность изобретения: конструируют рекомби- нантные плазмидные. ДНК, кодирующие мутантную ацетолактатсинтетазу табака, трансформируют полученными ДНК клети Brassica, или картофеля, или табака, или сахарной свеклы, или дыни, или хлопчатника, или люцерны, отбирают трансформированные клетки, получают суспензионные каллусные культуры, проводят культивирование каллусной ткани и получают регене- ранты, устойчивые к гербициду. 14 табл. ел

Среда для культивирования N.tabacum

K3/S (1) - сахароза, фитогормонный режим 1 (повышенный)

K3/G (1) - глюкоза, фитогормонный режим 1 (повышенный)

K3/G (2) - глюкоза, фитогормонный режим 2 (пониженный)

1-NAA 3,0 мг/л 2-NAA 0,1 мг/л ВАР 1,0 мг/л ВАР 0.1 мг/л рН доводят до 5,7. стерилизуют на фильтре и хранят при 5°С.

Распределяют 25 мл на чашку Петри (tOO x 25 мм) и при необходимости прибавляют

Среда QMS (для поддержания растений) Компонент

Соли-макроэлементы Fe ЭДТК

Микроэлементыi MS I

селективные агенты в стерильных условиях после охлаждения среды до 50°С.

агрузка

10Х

100Х

1000Х

Конечная

1

Коя-во/л

100 мл 10 мп

МЛ Jk

Для отвеждения среды: агар (15 г/л) фирмы Dlfco Bacto автоклааируют в отдель(ЭДТК полностью растворяют перед прибавлением значение рН доводят доЗ)

ном объеме 500 мл. Перед посевом соли и агар смешивают.

Дополнительное оборудование, химические препараты и среды, MES-буфер

П р и м е р 2. Получают ДНК табака из мутанта СЗ и конструируют, как описано в примере 1, геномную библиотеку ДНК на бак- териофаговом векторе EMBL3. Фаг, несущий гены АЛС, идентифицируют, как описано в примере t, посредством гибридизации с 51- концом зонда фрагмента гена АЛС табака, меченным Р.

Шесть независимых рекомбинант- ных фагов изолируют путем скрининга из 600 000 рекомбинантов из библиотеки мутанта СЗ. Анализ рестрикционной эндонуклеа- зы этих изолированных фагов показывает, что

ДНК-естааки из 3 фагов могут быть линеэр- ны с геном SURA из библиотеки мутанта Нга (фаги 35,36 и 38). Остальные 3 фага (фаги 31, 34 и 37) содержат вставки ДНК, соответствующие гену SURB. Как полагают, ген АЛС в фагах 35, 36 и 38 является геном SURA-C3, кодирующим гербицидустойчивую АЛС, а ген АЛС в фагах 31, 34 и 37 является геном SURB, кодирующим гербйцидчусствитель- яуюАЛС.Фрагменты ДНК из фагов 31, 35 и 38 субклонируют в плазмидуриС119, а затем в бинарный вектор плазмиды pAGS135, в осно.вном как описано в примере 1. Фрагмент рестрикционной эндонуклеазы Spe I из фага 31 (размером примерно 8,3 кб), аналогичный фрагменту, содержащемуся в плаз ми де pAGS148, но несущий ген SURB, кодирую- щий гербицидчувствительНую АЛС, субкло- нируют в обеих возможных ориентациях в векторе, Фрагмент рестрикционной эндонуклеазы Spe l-Sal I (размером примерно 6,3 кб) из фага 35 и фрагмент Spe - Sal I (размером примерно 7,8 кб) из фага 38 суб- клонируют с получением pALS35 (ATCC № 67424) и PALS38, соответственно. Указанные фрагменты включают 2,5 кб участка, кодирующего АЛС, в направлении 5 -конца (по направлению вниз), 2 кб АЛС-кодирую- щей последовательности, кодирующей гер- бицидустойчивый энзим и 1,8 и 3,3 кб, соответственно, АЛ С-кодирующего участка в направлении З1 -конца (по направлению вверх). Последние два субклонированных фрагмента содержат сайт рестрикционной эндонуклеазы ВатН I. Частичные переваривания BamH I или pALS35 и pALS38 используют для вставления этих плазмид в сайт ВатН I бинарногЬ вектора плазмиды pAGS135. Гены АЛС в бинарном векторе, обозначенные р312, р313,р351 и р381 (таблица 7) переносят в A.tumefaciens путем трехродительского скрещивания, как описа- но в примере 1.

Введение генов АЛС в гербйцидустой- чивые клетки табака путем совместного культивирования растительных клеток с A.tumefaciens, несущим гены АЛС, в бинарный вектор проводят по методу, описанному в примере 1. Полученные результаты экспериментов по совместному культивированию представлены в табл.7. Как ожида- лось, ген АЛС, изолированный в фаге 31, т.е. ген SORB, кодирующий гербицйдчувстви- тельную АЛС, не дает никаких гербициду- стойчивых растительных клеток. Ге н АЛС, изолированный в фагах 35 и 38, т.е. ген SURA-C3, кодирующий гербицйдустойчи- вую АЛС, действительно дает растительные клетки, устойчивые к гербициду. Растительные клетки, устойчивые к гербициду, образуются при более низкой частоте, чем растительные клетки, устойчивые к канами- цину, а также при более низкой частоте, чем наблюдается в случае, когда используют ген SURB-Hra: Это может быть в связи с меньшей устойчивостью к гербициду АЛС-энзи- ма, кодирующегося геном SURA-C3, по сравнению с АЛС-энзимом, кодирующимся геном SURB-Hra, либо в связи с более низкой экспрессией гена SURA-C3 по сравнению с геном SURB-Hra. либо и с тем. и с другим.

Пример 3. Осуществляют мутации в гене SURA дикого типа табака In vitro, чтобы он кодировал гербицидустойчивую АЛС. Фрагменты рестрикционной эндонуклеазы. содержащие часть гена SURA, субклониру- ют в фаговые векторы М13 или плазмидные векторы, содержащие начало М13 репликации для получения однонитиевой ДНК. Специфический фрагмент ДНК, который еубклонирован, зависит от участка, подвергаемого мутагенезу in vitro, и наличия сайтов рестрикционной эндонуклеазы.

Синтезируют олигонуклеотиды длиной 16-17 оснований, которые гибридизуются с однонитиевой ДНК из АЛС-гена SURA с одноосновными неправильными подборами. Эти неправильные подборы предназначены для превращения аминокислотных кодонов, обнаруженных в гене АЛС дикого типа, в кодоны, обнаруженные в генах АЛС, которые кодируют АЛС-энзимы, устойчивые к гербицидам на основе сульфонилмочевины. Указанные олигонуклетоды содержат фрагменты: 5 GTTCAATTGGAGG АТС З1, для замены trp59tHaleu,

51 GTCAAGTGGCACGTAGG31, для замены pro 197 на ala, и

51 GTCAAGTGTCACGTAGG 31, для замены pro 197 на ser,

51 ATGTACCTGAGGATATT З1, для замены lys 256 на gtu.

51 GAGGTTTGTTGATAGAG З1, для замены asp 384 на val,

51 AGGTTTGAGGATAGACT 3. для замены asp 384 на glu,.

51 TACTGATGATTTTCAGG З1, для замены ala 205 на asp и

51 CAGGTGGCCCTTCCATG З1, для замены ala 122 на pro.

Указанные олигонуклеотиды гибридизу- ют с однонитиевой ДНК и используют в качестве праймербв для синтеза комплементарной нити в реакции, катализируемой фрагментом Кленова ДНК-попимеразы 1. Полученную ДНК трансформируют в компетентные клетки E.coli mutl. Отдельные бляшки или колонии очищают в зависимости от того, использованы ли фаговые векторы М13 (Ml3 mp 18/19) или плазмидные векторы М13 (pTZ18R/19R) начала репликации. Минипро- дукты однонитиевой ДНК получают и используют в реакциях секвенирования ДНК для идентифицирования клонов, несущих мутированные основания.

Эти сконструированные in vitro сайтс- пецифические мутации можно вставлять индивидуально или в комбинации в ген SURA дикого типа, который содержит 51 - и З1 -концевые регуляторные последовательности, необходимые для обеспечения экспрессии гена в растительных клетках (см. пример 2). Такое включение достигают путем замены фрагментов рестрикционной эндонуклеазы, несущих мутации плэзмидой, содержащей ген SURA, из которого удален аналогичный фрагмент. Выбор рестрикционного фрагмента для замены зависит от положения мутации в гене и от наличия сайтов рестрикционной эндонуклеазы. Введение мутированных генов SURA в растительные клетки далее осуществляют по мето. ду, описанному в примерах 1 и 2. Любой из фрагментов ДНК, содержащих мутации, которые приводят к получению гер- бицидустойчивой АЛС, как раскрыто в описании настоящего изобретения, можно получить в основном по этому методу. Кроме того, нет необходимости осуществлять мутации только в гене SURA. Ана логичные мутации можно осуществлять в гене SURB или в любом другом растительном гене, кодирующем АЛС, для которого доступна информация о ДНК-последовательности.

П р и м ё р 4. ДНК получают из Beta vulgarls сорта Sennika (сахарная свекла), а теномную библиотеку ДНК в векторе EMBL3 бактериофага лямбда конструируют, как описано в примере 1. Рекомбинэнтныефаги (300 000) подвергают скринингу путем гибридизации с зондом, меченным Р, фрагмента гена АЛС табака на 5 -конце, как описано в примере 1. Фильтры промывают при 42°С (0,TXSSC) и выделяют 20 индивидуальных клонов. На второй стадии очистки рекомбинантный фаг гибридиэуют с обоими З1 - и 51 -концами зонда гена АЛС табака. Кроме того, фильтры, которые гидридизиро- ваны с зондом 5 -конца, промывают при 55°С. Только один клон ф21 гибридизуется с обоими 51 - и З1 -концами зонда,, причем концы остаются тибридизованньчии после промывки при 55°С: Препараты минилиза- тов ДНК получают из 20 клонов и переваривают с помощью EcoR I и Ncol. Различные изоляты содержат разные фрагменты, полученные в результате обработки рестриктаза- ми, причем опять только ф21 гибридизирован с обоими зондами и остается гибридизиро- вэнным после промывки при 55°С. Один фаг, а именно ф41, также содержит полосу гибридизации, которая остается после промывки при 55°С, тем не менее он не гибридизируется с зондом на З1 -конце. Участок,

кодирующий АЛС, связывают с фрагментом BamH I - Hind III размером 3 кб путем гибридизации с зондами из гена N.tabacum на 5 51 - и З1 -концах. Обе нити ДНК этого фрагмента секвенируют. Фрагмент BamH I - Hfnd 111 субклонируют в векторы pUC119 или Bluerscrlpt; затем генерируют делеции эк- зонуклеазы III или Bal 31. Это осуществляют 0 методом дидезокси-секвенирования. Сравнительный анализ.выведенной аминокислотной последовательности, кодируемой геном сахарной свеклы, с этой же последовательностью гена (генов) табака указывает

5 на отсутствие гомологии в первых 88 аминокислотах предполагаемого белка. Указанный участок может представлять собой пептид перехода в хлоропласт. В связи с этим гомология составляет примерно 90% в

0 случае вставки 4 аминокислот вокруг остатка 290 АЛС табака. Проверка аминокислотных остатков, которые определяют сайты для гербицидной устойчивости, установля- емой в табаке и дрожжах, указывают на то,

5 что указанные остатки консервируются также и в АЛС сахарной свеклы. Полученные данные позволяет осуществить прямой подход к конструированию гена, кодирующего энзим АЛ С сахарной свеклы,

0 устойчивый к гербицидам, посредством сайтспецифического мутагенеза, как описано в примере 3.

В этом гене сахарной свеклы подвергают мутагенезу три сайта. Кодон GCA для ala

5 в положении 122 заменяют ССА для pro, кодон ССА для pro в положении 197 заменяют CGA для ala и кодон TGG для trp в положении 591 заменяют TTG для leu. Двойные мутации, изменяющие pro на ala в положе0 нии 197 и trp на leu в положении 591, которые имеют сходное действие с геном SURB-Hra табака, также проводят путём комбинирования двух отдельных мутаций.

5

Для трансформации растений посредством указанных мутаций, сконструированных in vitro, в гене АЛС сахарной свеклы, в плазмидный вектор pUC119 клонируют

0 фрагменты ДНК, содержащие мутации и проходящие от сайта BamH I размером примерно 910 п.н. в 51-концевом направлении (по направлению кверху) кодирующего уча- сТка до сайта Pst I размером .1000 п.н. в З1

5 -концевом направлении (по направлению книзу) кодирующего участка. Указанные фрагменты вставляют в бинарный вектор pAGS140 для трансформации в клетки растения, как описано в примере 1. Указанный бинарный вектор pAGS140 аналогичен век-с

тору pAGS135, за исключением того, что между сайтом ВатН I и правой границей Т-ДНК П-плазмиды Agrobacterium tumefaciens вставляют ген, который придает устойчивость растениям к антибиотику гмгромицину.

Введение генов АЛ С в табак и сахарную свеклу, чувствительные к гербициду, путем совместного культивирования рэститель- ных клеток с помощью A.tumefaciens, несущего гены АЛС в бинарный вектор, проводят, как описано в примерах 1 и 2. Полученные результаты совместного культивирования на табаке представлены в табл.8. Гербмцидустойчивые трансформанты получают с помощью 3 или 4 мутантных генов АЛС сахарной свеклы. Частота выхода гербицидустойчивых трансформантов, ниже, чем для трансформант.ов, устойчивых к канамицмну, и ниже, чем частота выхода гербицидустойчивых трансформантов при использовании гена SURB-Hra табака. Полагают/что это вызвано слабой .экспрессией мутантных генов АЛС сахарной свеклы в табаке. Вышеуказанное можно объяснить либо недостаточными регуляторными последовательностями нуклеотидов; располо- женных по направлению книзу или кверху от мутантных генов АЛС сахарной свёклы в используемых фрагментах ДНК, либо плохой утилизацией регуляторных последовательностей нуклеотидов сахарной свеклы в табаке.

Введение генов осуществляют стандар- тным способом совместного культивирования. Для каждого построения аликвоту совместно культивируемых растительных клеток (исходная концентрация растительных клеток 2Х105) отмеривают для устойчи- вости к Ялорсульфурону, и другую аликвоту - для устойчивости к канамици- ну. Селекцию осуществляют при 2 ч. на млрд. хлорсульфуронаили при 50 ч. на млн. канамицина. ..

П р и м е р 5. Ге.н SURB-Hra, описаный в примере Т, трансформируют в культурные сорта табака заражением Agrobacterium t.umefaciens пластинок табачных листьев, потомство трансформантов анализируют с тем, чтобы продемонстрировать экспрессию устойчивости на уровне целого растения и наследственность признака гербицидной устойчивости, Затем поступают стандартными стерильными методами для манипули- рования стерильными средами и аксеиными культурами растений и бактерий включая использование колпака с ламинарным потоком для всех переносов. Растения табака для заражения листовых пластинок высевают в чашки и выращивают в растильне: 12 ч при дневной температуре 24°С и 12 ч при ночной температуре 20°С, относительной влажности около 80%. при смешанном холодном белом свете флуоресцентного и накаленного свечения осуществляют заражение пластинок табачных листьев.

Молодые листья, не полностью распустившиеся и имеющие длину примерно 4-6 дюймов (10,16-15,24 см), собирают скальпелем с растений табака возраста примерно 4-6 недель (Nlcotlona tabacum, сорт CV.NK326 или К14). Листья поверхностно стерилизуют в течение 30 мин погружением их в 500 мл 10%-го раствора Chlorox, 0,1%-го раствора додецилсульфата натрия и затем промывают 3 раза стерильной деи- онизированной водой. Пластины листьев диаметром б мм получают из целых листьевс использованием стерильного бумажного пуансона.

Пластины листьев инокулируют погружением их в течение нескольких минут в 20 мл ночной культуры Agrobacterium (разбавление 1:10), несущей плазмиду pAGS152. Культуры Agrobacterium появляются после инокулирования 10 мл бульона Min A (пример 1) с единственной бактериальной колонией, удаленной из бляшки с бульоном Mln А и тетерциклина (пример б ). Культуру выращивают в течение примерно 17-20 ч в стеклянных пробирках (18 мм) с культурой в качалке с платформой типа New Brunswick, поддерживая температуру при 28°С.

После инокулирования пластины листьев помещают на чашки Петри, содержащие среду с агаром CN (пример 6). Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют при смешанном освещении для растений, т.е. флуоресцентном и Gvo and Sho (General Electric) в течение 2-3 суток в камере для культивирования, где температуру поддерживают примерно при 25°С.

Чтобы освободить пластинки листьев от Agrobacterium и отобрать для выращивания трансформированных клеток табака, пластинки листьев переносят на свежую среду CN, содержащую 500 мг/я цефотаксима и 100 мг/л канамицина. Цефотаксим сохраняют в виде замороженного основного раствора (концентрация 100 мг/мл) и прибавляют в стерильных условиях (стерилизуют через 0,45 мкм фильтр) к средам после автоклавирования. Свежий раствор канамицина (50 мг/мл) приготовляют для каждого использования и стерилизуют через фильтр, пропуская его в автоклавированные среды.

Пластинки листьев инкубируют в условиях культивирования, описанных выше, в течение 3 недель и затем переносят на све- жие среды такого же состава.

Всходы возраста приблизительно 1-2 недель, развивающиеся на канамицин-ото- брэнных эксплантатах, подрезают стерильным скальпелем и высевают в среде А, содержащей 100 мг/л канамицина. Корне- образование на селективных и неселективных средах регистрируют в пределах 3 недель. Всходы, которые укореняются в ка- намицине, переносят в почву и выращивают в растильне, как описано выше. Через 3-5 недель, но перед тем, как происходит цветение, листовую ткань вырезают и используют для анализа А Л С, как описано в примере 6. Результаты этих анализов, которые указывают на то, что развивается герби- цидустойчивая форма АЛС, приведены в табл.9. Растения, проявляющие активность гербицидустойчивой АЛС, затем переносят в теплицу, где они растут до зрелости. Отдельные цветки заключают в мешки для то- го, чтобы позволить самооплодотворение без перекрестного опыления. Зрелые семена собирают и осуществляют испытания по качеству потомства для определения наследственности признака гербицйдной устой- чивости. Семена поверхностно стерилизуют, как описано выше, сушат, и семена сажают на среде SG (1/4 соли MS, 0,75% сахарозы. 0,8% агара) в присутствии или отсутствии гербицида (DPX-F6025, CfassfcR). Чувстви- тельные семена прорастают, но далее не развиваются. Результаты испытания по качеству потомства приведены в табл.9. Сегрегационное соотношение трех устойчивых потомств по сравнению с одним чувстви- тельным потомством указывает на присутствие вставки на одном сайте гена SURB-Hra в трансформант, который является стабильно унаследованным. Это наблюдают в 15 случаях из 17 трансформантов. Более высокие со- отношения устойчивых потомств к чувствительным показывают множественные вставки в несвязанных положениях в геноме. Соотношение 15:1 указывает на присутствие двух несвязанных генов SURB- Нга, а соотношение 255:1 - на присутствие четырех несвязанных генов SURB-Hra в трансформантов К14 N 40 и К14 №:7 соответственно.

Примерб. Для трансформации герби- цидчувствительного .томата в гербициду- стойчивый используют ген SURB-Hra из табака, переносимый на бинарном векторе

pAGS152 в штамме A.tumofar.ions LHA.4104 (см. пример 1).

Следуют стандартным стерильным методикам для манипулирования стерильных сред и аксенных культур растений и вакге рий. включая использование коппака с ламинарным потоком для всех переносов. Семена томата (Lycopersicon esoulentum сорт Herbst Res Cherry) поверхностно стерилизуют в течение 30 мин в 10%-ом растворе Chlorox, 0,1 %-ом растворе дедоцилсульфата натрия и промывают 3 раза стерильной де- ионизированной водой. Семена сажают в ящиках Magenta (Magenta Corp.). содержащих 100мл среды с агаром OMS. и инкубируют при смешанном освещении для растений, т.е. флуоресцентном и Gro and Sho (General Electric) в растильне, поддерживая в ней температуру около 25°С. Семядоли от всходов 10- 15-дневного возраста используют для инокуляции Agrobacterium.

Семядоли скарифицируют путем отщепления около 2 мм ткани от каждого конца семядоли при помощи стерильного скальпеля. Скарифицированные семядоли высевают на чашки Петри на среду с агаром СТМ либо в присутствии, либо в отсутствии 75 мкм ацетосирингона (Aldrich Chemical).

Для приготовления инокулирования семядолей единственную бактериальную колонию с чашки с агаровой средой Min А и тетрациклина (1 мкм/мл) инокулирут в колбу, содержащую 30 мл бульона Min А (пример 1), и выращивают в течение 2 суток при 28°С в качалке с платформой New Brunswick. В то утро, когда инокулируют семядоли, культуру бактерий разбавляют стерильным бульоном Min А до оптической плотности 0,1 при 650 нМ и ей дают размножаться до оптической плотности 0,2 в условиях выращивания, описанных ранее. Эту культуру затем используют неразбавленной для инокулирования.

Чашки с агаром СТМ, содержащие эксплантаты семядолей, наполняют 5 мл бактериального раствора в течение приблизительно 5 мин перед тем, как удалить раствор. Затем чашки закрепляют лентой Time Tape (Shamrock Scientific Specialty) с двух сторон чашки и инкубируют в течение 2 суток при смешанном освещении для растений, а именно флуоресцентном и Gro and Sho (General Electric) при температуре около 25°С.

Чтобы освободить растительные культуры от Agrobaeterlum и отобрать .для выращивания трансформированных клеток томата, эксплантаты семядолей переносят в

свежую среду СТМ, содержащую 500 мг/л цефотаксима и 50 мг/л канамицина, и инкубируют их при таких же улсовиях культивирования, которые описаны выше, в течение приблизительно 3 недель. Затем семядоли переносят в свежие среды с таким же составом и селективными веществами, как и среда СТМ, однако при 1 /10 концентрации зеатина.

Приблизительно через 2-4 недели всходы, развившиеся из канамицинотобранных семядолей, отрезают и высевают в средах OMS, содержащих 500 мг/л цефотаксима и 100 мг/л кзнамицина. Всходы томата, которые усокренились в канамицине через 2-3 недели, переносят в почву в 8-дюймовых (20,32 см) сосудах и накрывают пластмассовыми мешками. Растения выращивают при смешанных флуоресцентном и накаленном свечениях: 12 ч при дневной температуре 24°С и 12 ч при ночной температуре 20°С, относительной влажности около 80%, в течение одной недели перед тем, как снять пластмасссовые мешки. Затем растения выращивают еще 2-4 недели и осуществляют испытание АЛС. В этих экспериментах по- казано повышение неингибированной активности АЛС в присутствии сульфонил- мочевины GlassicR в экстрактах листьев из трансформированных растений (табл.10).

Анализ активности АЛС в отсутствии или в присутствии гербицида из трансформированных или нетрансформированных растений осуществляют следующим образом:

Среда индукции каллюса .

1 упаковка солей-MS

(Glbco Murashtge

Qrganics Medium)

с 3%-ной сахарозойна 1 п

1 мл 1 мг/мл МАЛрН 5,8 0,2 мл 1 мг/мл ВАР 0,8% агара

CN

Среда индукции всходов 1 упаковка соелй MS с 3% сахарозына 1 л 1 мл 1 мг/мл NAA рН 5,8 1 мл 1 мг/мл ВАР 0,8% агара

А

Среда корневой индукции 1 упаковка солей MS (без сахарозы)на 1 л

ТО г сахарозырН 5,8 0,8% агара

R-среда Argobacterium Прибавляют 7,5 г агара к 440 мл воды, автоклавируют и сохраняют при 55°С. Прибавляют следующие стерильные компоненты:. 0,5 мл 1М раствора MgSCk 0,5 мл 1М раствора CaCla 10,0мл 20%-ной сахарозы 5,0 мл 100 мг/мл канамицина 50,0мл 10 х сол ей

(60 г/л NaaHPCU 7Н20 30 г/л КНаРСм; 5 г/л NaCI; 10г/лМН4С1) Среда СТМ 1 упаковка солей MS 1 мл витаминов В5 (на 100 мл; 100 мг никотиновой кислоты, 1000 мгтиа- мин гидрохлорида, 100 мг пиридоксин- .гидрохлорида, 10000 мг мионизи- та)

1 мМ MES

3% глюкозы« 0,7% агара рН 5,7

Смесь автоклавируют и прибавляют 1 мл 1 мг/мл раствора зеатина.

Среда OMS 1 упаковка солей MS 1 мл витаминов В5 (см. выше) 3 мМ MES 3% сахарозы 0,8% агара РН5.7 Среда Mln A + 1 мкг/мл тетрациклина

К2НР045,25 г

КН2РО42,25 г

(NH4)2S040,5 г

Лимоннокислый

натрий -2Н200,25 г/100 мл

Для получения среды Min A + 1 мкг/мл тетрациклина смешивают (1) и (2), прибавляют 0,5 мл (3), 5 мл (4) и 0,5 мл (5).

Среда УЕВ

Бактомясной экстракт Бактодрожжевой экстра Пептон. Сахароза MgSO 7Н20 Агар (при желании)

Гербицидные растворы: 1 ч. на млн. основного раствора гербицида на основе сульфо- нилмочевины можно получить растворением 1 мг гербицида в 100 мл 0.01 N МНзОН с последующим разбавлением (соотношение 1:10) путем добавления 5 мМ КНРСм, рН 7.

Эта смесь достаточна для испытания гербицида при концентрации 100 ч. на млрд. или ниже. Если требуются более высокие концентрации, растворяют 1 мг е 10 мл 0,0IN NH40H и т.д.

Гербицидные разбавления: При прове- дении стандартного испытания 50 мкл гербицида прибавляют к 450 мкл испытуемой смеси и экстрагируют, для 1:10 разбавления гербицида. Итак, для каждой испытуемой

концентрации следует разбавить 10х раствор в 5 мМ КНРСм, рН 7, из основного раствора.

Пример. Ген SURB-Hra табака, кодирующий гербйцидустойчивую АЛС, используют для трансформации Beta vuigaris (сахарная свекла) с использованием Agrobacterlum tumefaclens.

Чтобы поверхностно стерилизировать семена, 50-100 семян помещают в стерильные чашки Петри (25 х 100 мм) в колпаке с ламинарным потоком и прибавляют 25-30 мл 70%-го этанола. Семена перемешивают вручную в течение 1-2 мин, этанол декантируют, после чего прибавляют 25-30 мл 20%го Chlorox (2G мл коммерческого отбеливателя (80 мл стерильной воды) 1 капля Tween 80). Семена перемешивают на ротационной качалке при скорости вращения 40 об/мин в течение 20 мин и отбеливатель декантируют. Стерилизацию отбеливателя повторяют 2 раза а течение всего 60 мин, стерилизованные семена промывают 3 раза в течение 5 мин, .каждый раз 25-30 мл стермльной воды..

Для прорастания семян последние высевают на чашки Петри (15 х 150 мм) со средой, отаержденной агаром 1/2 PGo (12 семян на 50 мл среды), и культивируют при 24°С в темноте.

Примечание. 10-20%-ное загрязнение семян можно ожидать для хорошей, чистой делянки с семенами. По этой причине семена высевают далеко друг от друга на больших пластинках и прорастания наблюдают непрерывно, незагрязненные семена

переносят к свежим пластинкам. Если загрязнение грибковое, тогда переносы осуществляют в камере с ламинарным потоком оез вентилирования.

60-80% всхожесть семян ожидают для хорошей делянки семян. Прорастание не синхронное. Необходимо приблизительно 14 суток для достижения а) всех всходов и б) достаточной элонгации с тем, чтобы получить много подходящих эксплантов.

Получают ночные суспензионные культуры (0/N) Agrobacterium, как описано enpi/r мере 1. Заново посеянная Agrobacterium имеет более короткий латентный период, чем культуры, сохраняемые в течение длительного времени при 5°С, Важно использовать логфазовые бактерии в качестве инокулятов. Поэтому необходимо провести испытание с тем, чтобы обеспечивать получение ночной культуры, которая достигает лог-фазы (оптическая плотность при 550 нм 0,4-0,8) перед инокулированием гипокоти- лий.

Для получения растительных эксплантатов гипотолии разрезают на сегменты около 0,5 см при помощи острого хирургического скальпеля и сразу высевают на чашки с PGo 0,1/0,1, отвержденный агаром. Необходимо следить за тем, чтобы не случилось высыхания или повреждения раны при использовании тупого скальпеля или при сжа- тии пинцетом.

Для инокулирования эксплантатов последние погружают отдельно в суспензию с лог-фазой соответствующего штамма Agrobacterium. Эксплантаты погружают на короткий срок (1-3 с) и располагают в решетчатой конфигурации на свежей чашке: 25 эксплантатов на 100 мм чашке PGo 0,1/0,1, отвержденной агаром.

Эксплантаты сушат, оставляя чашки открытыми в кояпаке с ламинарным потоком в течение 10-30 мин. Вследствие этого Agrobacterium концентрируется на бане. Это также может ограничить возможное повреждение, наносимое водой. При этом очень важно следить за тем, чтобы ткань не .повредилась. Требуется тщательное наблюдение за данной стадией. Затем чашки герСреды и структурообразователи

метизируют пара-пленкой и культивируют при 24°С в течение 3 суток.

Эксплантаты собирают в жидкой PG 0,1/0,1, содержащей цефотаксим при концентрации 500 мкг/мл в чашках Петри (25хТОО мм), и осторожно встряхивают на ротационной качалке при скорости вращения 40 об/мин в течение 1 ч. Среду декантируют, заменяют свежими противоселективными средами и встряхивают осторожно в течение еще 2 ч. Эксплантаты высевают в решетчатой конфигурации на чашки (25 х 100 мм) со средой PG 0,1 /0,1, отвержденной агаром и содержащей цефотаксим (500

мкг/мл), и культивируют при 24°С в течение 3 суток.

Отбор трансформированных растительных клеток осуществляют следующим образом. Эксплантаты переносят на свежие

чашки со средой PG 0,1/0,1, отвержденной агаром и содержащей 100 мкг/мл ванкоми- цина или 2 нг/мл хлорсульфурона в качестве селективных агентов. Число устойчивых колоний подсчитывают через 20-30 дней. В

каждой ране можно наблюдать более чем

.: одну колонию. Трансформанты отщепляют

следующим образом. Каллюс удаляют из раны/экслланта хирургическим скальпелем и

культивируют независимо друг от друга на

свежих селективных средах. Некоторые Agrobacterium могут избежать контрселе- кии. .Возможны дополнительные промывки в жидких средах, содержащих цефотаксим, а также повторные переносы к цефотаксимсодержащим чашкам, отвержденным агаром. С соблюдением предложенных правил можно установить приблизительно 15% загрязнения эксплантатов, которые являются допустимой потерей. Результаты эксперимента по трансформации с использованием линии клеток Beta vulgaris 87193 сахарной свеклы приведены в таблице 11. Уровень устойчивости к хлорсульфурону в каллюсах В.Vulgaris, трансформированной мутантным АЛС-геном SURB-Hra табака, сравнивают с уровнем устойчивости к хлорсульфурону в нетрансформированных каллюсах. Эти результаты показывают, что ген SURB-Hra табака, кодирующий гербицидустойчивую

АЛ С, может быть эффективно экспрессиро- ван в сахарной свекле.

Основные растворы

ПримерВ. Ген SURB-Hra табака, кодирующий гербицидустойчивую АЛ С, используют для трансформации Brasslca napus, сорт Olga.

Для поверхностной стерилизации семян последние погружают на 1 мин в 70%- ный этанол, затем на 30-60 мин в раствор Chlorox/Tween (см.пример 7). Поверхностно стерилизованные семена культивируют на 1/2 MS, 1/2 PGo (см. пример 7) при 24°С в темноте. Через 5-10 дней после прорастания гипокотоли разделяют на участки 0,5 см и помещают на твердой среде I, содержащей 100 мкм Ацетосиригона (1AS100).

Gpa3y же эксплантаты окунают по отдельности в суспензию логфазы LBA4404, содержащей бинарную плазмиду pAGS15.

Эксплантаты высевают обратно на IAS100. Капельку Agrobacterlum осторожно сушат на ткани за счет оставления пластинки открытой в колпаке с ламинарным потоком. Совместное культивирование осуществляют при 24°С при малом свете или ъ темноте в течение 3 суток.

Через 3 суток эксплантаты собирают в жидкой сере 1, содержащей 500 мг/л цефо- таксима, в чашках Петри (25x100 мм) и встряхивают на ротационной качалке при скорости вращения 40 об/мин в течение 3 ч.

Эксплантаты высевают на твердую среду 1, содержащую 500 мг/мл цефотаксима, и культивируют в течение 3 суток при 24°С при малом свете.

Эксплантаты высевают на чашки с твердой средой 1, содержащей 100 мг/л ванко- мицина и 100 мг/л канамицина.

Приблизительно через 1 месяц трансфер 1 мированные каллюсы появляются в виде дискретных узелков на концах эксплантатов.

Сразу после появления узелки отрезают острым скальпелем и высекают на твердую среду 1, содержащую 100 мг/л канамицина.

Когда трансформированный каллюс достигает достаточного размера (диаметр 0,5

см), его переносят к среде KR, содержащей 100 мг/л канамицина. Этот материал регенерируется быстрее, если его высевают на свежие среды каждые две недели. Корни

регенерируют на 1 /2 MS, содержащей 2 мкм IBA.

В одном эксперименте из 100 скарифицированных сайтов (любой конец сектора гипокотиля 0,5 см) 20 развили каллюсовую

ткань, которая была устойчивой к канамици- ну при его концентраций 100 мг/л. Пять из 20 трансформированных линий клеток последовательно индуцируют для регенерации на канамицине, соматические, скрещивающиеся. между собой сибсы для каждого ре- генрирующего генотипа были получены узловым размножением. Эти растения опрыскивают различными концентрациями хлорсуль- Фурона, резул ьтаты приведен ы в табл. 12. Два из

пяти трансформантов устойчивы к хлорсульфу- рону на уровнях, которые приблизительно в 10 раз выше уровня, летального для контрольных (нетрансформированных) растений.

Для дальнейшей демонстрации экспрессии гена SURB-Hra в трансформированном Brasslca napus осуществляют испытание АЛ С в присутствии гербицида хлосульфурон, как описано в примере 6. Сравнивают активности АЛС нетрансформировэнного родителя и трансформанта RO № 5 (табл.12). Результаты приведены в табл.13. В трансформанте наблюдается неуклонное повышение процентной доли ин- гибирования активности АЛС. Таким

образом, ген SURB-Hra табака, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, может экс- прессироваться в Brasslca napus, однако эта экспрессия не является эффективной. Добавление нуклеотидных регуляторных

последовательностей Brasstca napus, как ожидают, могло бы повысить уровень экспрессии гербицидустойчивой АЛС и уровень выдерживаемости к лиственному введению гербицида.

Эти стерилизованные на фильтре компоненты прибавляют асептически

.При м е р 9. Ген SURB-Hra табака, кодирующий гербицидустойчивую АЛ С, используют для трансформации Cucumis meJo, сорт Amarlllo Ovo (дыня).

Поверхностная стерилизация семян в значительной степени упрощается первоначальным удалением семянной оболочки. Затем семена стерилизуют промывкой в 70%-ном зтаноле в течение 2 мин, после чего семена промывают в смеси Chlorox и Tween (см. пример 7) в течение 20 мин. Стерильные семена промывают 3 раза в стерильной дистиллированной воде и прорастают на среде OMS при 24°0 в течение 16-часового дня. Семядоли всходов дыни возраста 7-14 дней разрезают на срезы 5 мм при помощи нового, острого скальпеля. Эти эксплантаты погружают в культуру Agrobacterium с лог-фазой, полученную, как описано-в примере 1. Затем эксплантаты переносят к новым чашкам для совместного культивирования и культивируют при 24°С в течение 3 суток (16 часов в день).

Бактерии убивают путем промывки экспланатов в течение 3 ч с осторожным перемешиваним и промывочных средах и культивируют на вежих чашках с селективной средой.

Эксплантаты субкультивируют каждые -4 недели, причем отсекают более компакные, более темно-зеленые секторы от белого ворсистого каллюса.

Когда Морфогенный каллюс (очень темно-зеленый, компактный, возможно, чуть узнаваемые листья) становится заметным, его переносят к регенерационным средам. Ткань может проходить прямо к росткам вместо того, чтобы проходить через морфогенную стадию. Всходы укореняются в корнеобразующих средах. Приблизительно 70% эксплантатов развивают каллюс, устойчивый к канамицину при концентрации 100 мкм/п. Трансформированный каллюс помещают на среды, содержащие возрастающие концентрации хлорсульфурона, и рост в присутствии гербицида определяют взвешиванием каллюса через 30 дн-эй (табл.14). Некоторые трансформанты растут при высоких концентрациях хлорёуяьфурО на (1000 ч, на млрд) так же хорошо, как и в его отсутствие, например транс 1, транс 2 И транс 7. Таким образом, ген SURB-HRa табака трансформирует дыню и обеспечивает высокий уровень гербицидной устойчивоСТИ, . ....

Измерения показывают многократное увеличение веса каллюса. Среды

OMS

Соли MS и Fe ЭДТК1х Витамины В5 1х Сахароза 3% MES ЗмМ рН5,7 :

Агар

0,8%

Автоклавирование в течение 20 минут

Основная среда Соли MS и Fe ЭДТК 1х Миоинозит100 мг/л Тиамин -% 1 мг/л Сахароза 3% MES ЗмМ , рН 5,7

Агар0,8% Автоклавирование в течение 20 мин В качестве среды для совместного культивирования используют основную среду плюс: 100 мкм ацетосирингона (ацетосирин- гон хранят как основной раствор 100 мМ в ДМСО) ..; . 6 мг/л кинетина 1,5 мг/л IAA

В качестве промывочной среды используют основную среду без агара плюс:

500 мг/л цефотакаима

6 мг/л кинетина

1,5мг/я IAA

В качестве селективной среды используют основную среду плюс: .6 мг/л кинетина

1,5 мг/л IAA

100 мг/л ванкомицина

Одно из следующих селективных яе- 0 карств в зависимости от конструкции Agrobacterlum:

100 мг/л канамицина

50 мг/л гигромицина

100 мг/л хлосульфурона 5 В качестве регенерационной среды используют основную среду плюс:

0,1 мг/л ВАР

ТОО мг/л ванкомицина

Описанные выше селективные лекарст 0 ва

В качестве корнеобразующей среды используют OMS плюс:

2 MKMlBA

100 мг/я ванкомицина

5 описанные выше селективные лекарства - - -.. .

ПримерЮ. Ген SURB-Hra табака, кодирующий гербицидустойчивую АЛ С, используют для трансформации Medicago 0 sativa, сорт Rangelander.

Рйстения выращивают и субкультивируют в OMS. Используемыми Материалами являются черешки и сегменты стебелька (длиной 5 мм) от растений приблизительно 5 через 2 месяца после последней субкультуры.

Черешки и стебли стерильных растений разрезают на 5 мм отрезки при помощи нового острого скальпеля. Эти эксплантаты погружают в культуру Agrobacterlum лог-фа- 0 зы, полученную, как описано в примере 1, переносят к свежим чашкам для совместного культивирования и культивируют при 24°С в течение 3 суток (16 часов в день).

Бактерии убивают путем промывки экс- 5 плантатов в течение трех часов с осторожным перемешиванием в промывочной среде и культивируют на свежих чашках с селективной средой,

Эксплантаты субкультивируют каждые .0 3-4 недели, Через приблизительно один месяц заметен трансформированный каллюс, выросший из обработанных концов эксплантатов, которые отрезают от эксплантата и высевают на свежие селективные 5 среды. Когда каллюс становится более организованным (участки более темно-зеленые и более компактные), его переносят к свежим средам для созревания.

Когда появляются развившиеся зародыши/их переносят к средам для прорастания. После прорастания маленькие растения выращивают на этой же среде.

Менее 1 % эксплантатов развивают кал- люс, устойчивый к канамицину при концен-, трации -ТОО мг/л. Канамицинустойчивые секторы находят устойчивыми к гербициду хлорсульфурон при концентрации 50 ч. на млрд. Из канамицинустойчивого к ал л юса получают 3 всхода. Ткань из этих трансформантов испытыва ют на гербицидустойчивый рост при разных концентрациях хлорсульфу- рона. Один трансформант способен расти при концентрации хлорсульфурона 1000 ч. на млрд. Остальные два способны расти при 5000 ч. на млрд. Таким образом, ген SURB- Нга табака может использоваться для трансформации люцерны и обеспечивает высокий уровень гербицидной устойчивости.

Среды

OMS

Соли MS и Яв ЭДТК1х Витамины В5 1х Сахароза 3% MES ЗмМ рН5,7

Агар0,8% Автоклавиррвание в течение 20 мин.

Основная среда

Соли MS и Fe ЭДТК1х Витамины UM 1х Сахароза 3% рН 5,7

Агар0,8% Автоклавирование в течение 20 мин. 100х витамины UM (количества указаны для 100 мл загрузки ЮОх)

Тиамин HCIt r Никотиновая кислота 0,5 г Пиридоксин HCI 1 г Миоинозит 10 г Глицин 0.2 г Среда для совместного культивирования:Основная среда плюс; 100 мкм ацетосирингона {ацетосирин- гон сохраняют в виде смеси 100 мМ в ДМСО) 2,4-D 0,5 мг/л ВАР 0,2 мг/л Промывочная среда Основная среда без агара плюс: Цефотаксим 500 мг/л 2.4-D 0.5 мг/л ВАР 0,2 мг/л

Селективная среда Основная среда плюс 2.4--D0.5 мг/мл ВАР 0.2 мг/л Ванкомицин 100 мг/л Одно из следующих селективных лекарств, в зависимости от конструкции Agrobacterlum

Гигромицин50 мг/л Хлорсульфурон 100 мг/л Среда для созревания: то же, что и селективная среда, но без 2,4-D

Среда для прорастания: Основная среда плюс ванкомицин100 мг/л Селективное лекарство, как описано выше. Формуя а изобретения Способ получения двудольных растений, устойчивых к сульфонилмочевине, предусматривающий получение суспензионных каллусных культур, отбор клеток, культивирование каллусной ткани и получение регенераторе, устойчивых к гербициду, о т л и ч а- ю щи и с я тем, что перед получением суспензионных каллусных культур конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pHraB1NpAGS152, или р735114, или p735D, или р735Н, или р73592, или рМ78, или рМ7А, или рМ7СА, или рМ7О.8, или рМ7Н8, или pM7AD, или рМ7АН, или рМ7А92. или рМ7А8, или pGVKAP, или pAGS589, или pAGS596, или pHGS594, или pAGS591, или P5T35D, или р5Т35Н, или pAGS351, или PAGS381, или pAGS140 с геном SURB-Hra, кодирующую мутантную ацетолактатсинта- зу табака, в которой Ala 122 замещен на Pro, или Pro 197 на Ala, или Pro 197 на Gin, или Pro 197 на Ser, или Ala 205 на. Asp, или Тгр 591 на Leu. или Ala 122 на Тгр и Тго 591 на Leu, или Pro 197 на Ala и Ala 205 на Asp, или Pro

197 на Gin и Ala 205 на Asp, и Pro 197 на Ala и Тгр 591 на Leu, или Pro 197 на Gin и Тгр 591 на Leu, или Pro 197 на Ser и Тгр 591 на Leu, или Ala 205 на Asp и Тгр 591 на Leu, или ацетолактатсинтетазу Arabiodopsls, в которой Pro 197 замещен на Ser, или ацетолак- татсинтетазу сахарной свеклы, в которой Ala 122 замещен на Pro, или Pro 197 на Ala, или Тгр 591 на Leu. или Pro 197 на Ala и Тгр 591 на Leu, и трансформируют полученными ДНК клетки Brassica, или картофеля, или табака, или сахарной свеклы, или дыни, или хлопчатника, или люцерны и отбирают трансформированные клетки.

.Таблица1

Результаты каллюсовых тестов табака, зараженного GVKNT13.

Количество трансформированных ростковых эксплуантатов, продуцирующих каллюс на селективных и неселективных средах :

Штамм Agrobacterlum, содержащий плазмиду Т|, несущую ген АЛС табака и ген NOS/NPTII (канамицинустойчивость)

Штамм Agrobacterlum, содержащий плазмиду TI, несущую только ген NOS/NPTII

Штамм Agrobacterium, содержащий плазмиду Т1 (лишенную либо гена АЛС табака, либо гена NOS/NPTH).

.Та бл ица2

Спонтанные мутации дрожжевого гена АЛС, приводящие к устойчивости к сульфонилмочевинномугербициду

Т я .6 л и ц а 3

Сайт-направленные мутации дрожжевого гена АЛС. приводящие к устойчивости к сульфонилмочевинному гербициду

.Т а б л и ц а 4 Перенос ДНК из фэгового клона 1 в чувствительные клетки N;tabacum

Некультивируемые совместно (контрольные) растительные клетки. Растительные клетки, культивируемые совместно с A.tumefaclens, содержащим

плазмиду pAGS145, с канамицинустойчивым вектором, содержащим ген табака для . экспрессии гербицидчувствительной АЛС из фаговрго клона 1.

Табл и ца5 :Перенос ДНК из фагового клона 3 в чувствительные клетки N.tabacum

Некультивируемые совместно (контрольные) растительные клетки.:

Растительные клетки, культивируемые совместно с A.tumefaciens. содержащим плазмиду pAGS 112, с канамицинустойчивым вектором.

Растительные клетки, культивируемые совместно с A.tumefaclens, содержащим плазмиду pAGS152, с канамицинустойчивым сектором, содержащим фаговый клон 3.

.:. ;. .. ... :- . . . ; . ..- .. ..-. Табл ица б

Уровень устойчивости к хлорсульфурону в клетках N.tabacum сорта W38, трансформированных мутантным геном АЛС 100 колоний, высеянных при каждом уровне хлорсульфурона.

Колонии, полученные из некультивированных (контрольных) растительных расте- /ний. -; . ... ; / ..... . ..;... ... - . . .. ..

Колонии, полученные в результате совместного культивирования (контрольных)

растительных клеток с A.tumefaclens, содержащей pAGS152 и первоначально селектированную за счет устойчивости к хорсульфурону при концентрации 2 ч/млрд.

Таблица

Эксперимент 3 по повторному введению АЛС

Перенос ДНК из фаговых клонов 31. 35 и 36 к чувствительным клеткам N.tabacum Число колонийобразующих единиц, происходящих от ТО5 протопластных эквивалентов через один месяц после совместного культивирования

Та б л и ц а 8

Гербицидная устойчивость в растительных клетках, трансформированных сайтспецифиче- скими мутантными генами АЛС сахарной свеклы

ТаблицаЭ

1 Активность АЛ С в каждой линии относится к активности в отсутствие гербицида, которая принимается за 100%. Используемый гербицид на основе сульфонилмоче- вины представляет собой DPX-F6025 (Classic ) при концентраций 10 ч.на млрд; 2Устойвое потомство способно расти при указанных концентрациях гербицида PPX-F6025 (Classic)

Активность АЛ С томатов трансформированного и дикого типов

Активности АЛ С в каждой линии относятся к активности в отсутствие гербицида, которую принимают за 100%. В качестве соединения сульфонилмочевины используют DPX-F6025, которое является действующим началом в гербициде Classic.

Линия 87193 Beta vulgarls, трансформируемая LBA4404 Agrobacterium tumefa- clens, несущим плаэмиду pAGS152. 2Нетрансформированная линия 87193 Beta vulgaris.

Продолжение табл. 9

Таблица 10

Та б л ица 11

нормальный рост, никакой осевой индукции; -и-уменьшенный рост, сублетальный у пчелы, осевая индукция; + уменьшенный рост, летальный у пчелы, осевая индукция; -летальный.

Таблица 13 Активность АЛС Brasslca napus дикого типа трансформированного Brassica napus

Активности АЛС даны по отношению к активности в отсутствие гербицида, которая принимается за 100%. Используемым соединением сульфонилмочевины является хлорсульфурон (DPX-W4189), который представляет собой действующее начало в гербициде GleanR.

Таблицам

Т ; б л и 11 я 12 10 ч. на млн.