Способ консервирования постоянных клеточных линий Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к криобиологии и может быть иЬпользовано для низкотемпературного консервирования постоянных клеточных культур.

Известные способы консервирования клеточных культур имеют ряд недостатков: требуют отмывания криопротекторов, основаны на применении неустойчивых при хранении криолротекторов или криопротекторов, полученных лабораторным синтезом в небольших количествах.

Наиболее близким к данному является способ консервирования клеточных культур, включающий замораживание их в присутствии 10% ДМСО по двухэтапной программе: до-30°С со скоростью 1°С/мин, затем до -70С со скоростью 4-6°С/мин с последующим помещением в жидкий азот на хранение.

Недостатком этого способа является необходимость отмывания клеток от криопротектора, что значительно усложняет процесс консервирования. Кроме того, ДМСО неустойчив при хранении: разлагается с образованием серосодержащих продуктов, обладающих резким неприятным запахом. Срок хранения до 1 мае.

Цель изобретения - упрощение процесса консервирования.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу консервирования постоянных клеточных линий, включающему замораживание в присутствии криопротектора на первом этапе до . на втором со скоростью 5°С/мин до с последующим погржением в .жидкий азот, замораживание осуществляется с криоконсервантом пропандиосахароль а разведении 1:2 - 1:5 со

скоростью замораживания на первом этапе 0,2 - 0,4°С/мин.

Криоконсервант пропандиосахароль содержит пропиленгликоль (1,2-пропандиол) 360 г, сахарозу безводную 32 г, натрий хлористый 6 г, воды для инъекций до 1 л. Криконсервант обладает низкой токсичностью и устойчив при хранении до 2 л. ЛД-50 пропандиосахароля серии 050186 для белых беспородных мышей 15,4 (14,0 - 17,0) г/кг, через 2,5 г хранения ЛД-50-15,6 (14,0 18,0) г/кг. Разработана технология на получение готовой стерильной лекарственной формы пропандиосахароля и нормативнотехническая документация (ВФС).

Л р и м е р 1. Сформировавшийся монослой клеток постоянной линии почки теленка (ПТ) в хорошем состоянии (клетки эпителиоподобного типа с четко выраженными границами) снимают с поверхности стекла культуральных сосудов смесью растворов версена и типсина в соотношении 4:1 бесцентрифужным методом и берут пробу для определения концентрации и жизнеспособности клеток. К суспензии клеток добавляют криоконсервэнт пропандмосахароль разбавленный питательной средой: 90% среды 199, 10% сыворотки крупного рогатого скота и 10Q мкг/мл канамицина сульфата, до конечного разведения 1:3,5 и концентрации клеток 1,9 х ТО /мл, Клеточную суспензию разливают в полиэтиленовые ампулы по 1,5 мл и запаивают. Эквмлибрацию клеток с крйозащмтной средой осуществляют 15-20 мин при комнатной температуре. Охлаждение проводят в программном замораживателв на первом зтапе со скоростью 0,3°С7мин до -30°С. на втором со скоростью 5°/мин до -70°С, после чего погружают в жидкий азот (-196°С) и хранят 20 дн. Отогревают в водяной бане при . Размороженные клетки переносят в культуральные флаконы, добавляют питательную среду до посевной концентрации клеток 1,9 X 10 /мл. Культивирование осуществляют при 37°С без замены среды через сутки. Жизнеспособность размороженных клеток определяют методом суправительного окрашивания раствором типанового синего, которая .составила 80,0%. По истечении 4 сут культивирования образцов монослой выполнен на 100% поверхности культурального флакона. Клетки имеют полигональную форму с хорошо выраженными границами. В цитоплазме отсутствуют видимые признаки цитопатологии. П р и м е р 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1 на клетках постоянной линии карцинома гортани (Нер-2). Замораживают в криоконсервирующих средах с различными разведениями пропандиосахароля 1:1; 1:1,5; 1:2; 1:3; 1:3.5; 1 : 5; 1:6, Самая высокая жизнеспособность клеток

обеспечивается при разведении пропандиосахароля 1;2 - 1:5. На 4-е сут культивирования монослой этих образцов выполнен на 100%, клетки имеют полигональную форму с четко выраженными границами, в течение

3 пассажей хорошо снимаются со стекла и пересеваются. Образцы, консервирован-, ные при разведении пропандиосахароля 1:1; 1:6, при культивировании образовывают островки на поверхности культуральных

флаконов и не пассируются.

Пример 3. Способ .осуществляют, аналогично примеру 1 на клетках постоянных линий Нер-2 и ПТ. Замораживание на первом этапе осуществляют с различными

скоростями 0,2, 0,3, 0,4. 0,5, 1,0, 5,0°С/мин. Жизнеспособность клеток Нер-2 и ПТ после замораживания с различными скоростями на 1-м этапе () приведена в табл.1. Из табл.1 следует, что для клеток Нер-2

оптимальными являются скорости 0,2 1,0°С/мин. Для клеток линии ПТ этот интервал уже 0,,4°С/мин, Поэтому отобран интервал 0,2 - 0,4 С/мин.

П р и м е р 4. Способ осуществляют

аналогично примеру 1 с клетками Нер-2 и ПТ. Параллельно консервируют клетки известным способом.

Жизнеспособность клеток Нер-2 и ПТ после замораживания различными способами на 1-м этапе () приведена в табл.2.

Из табл.2 следует, что жизнеспособность Клеток, консервированных предлагаемым способом, такая же, как и в известном. Фор мула изобретения

Способ консервирования постоянных

клеточных линий путем замораживания их в присутствии криопрОтектора на первом этапе до -30°С, на втором со скоростью 5 град/мин до -70°С с последующим погружением в жидкий азот, отличаю щийс я тем, что, с целью упрощения процесса, замораживание осуществляют с криоконсервантом пропаидиосахароль в разведении 1:2 - 1:5, а скорость замораживания на

1 этапе 0,2 - 0,4 град/мин.

Таблица 1

Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано для низкотемпературного консервирования постоянных клеточных культур. Цель изобретения - упрощение процесса консервирования клеточных культур. Для этого в способе консервирования постоянных клеточных линий, включающем замораживание в присутствии криопротектора на первом этапе до -30°С, на втором со скоростью 5 град/мин до -70°С с последующим погружением в жидкий азот, замораживание осуществляется с криоконсервантом пропандиосахароль в разведении 1:2-1:5 со скоростью замораживания на первом этапе 0,2 - 0,4 град/мин. 2 табл.(Л

Таблица 2