Способ криоконсервирования живых одноклеточных организмов Советский патент 1984 года по МПК A01N1/02 

vl

О5

СП 4 Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано для криоконсервирования различных биологических объектов, в частности свободноживущих одноклеточных животных, при проведении научных исследований, а также в микробиологии и медицине. Известен способ консервирования биологических объектов путем замораживания их в различных хладагентах. При этом объект предварительно обрабатывают крио протекторами, повышающими вязкость их цитоплазмы, а замораживание производят в хладагенте, например жидком азоте. Замораживание чаще всего проводят путем ступенчатого охлаждения объектов с широким .диапазоном градиента понижения температур от 0,2 град/мин до 1000 град/с 1J. Этот способ позволяет криоконсервировать только клетки организмов либо низшие организмы, например, соматические клетки, спермии, цисты, бактерии, водоросли и паразитические простейшие. Однако этот способ не пригоден для консервирования свободноживущих одноклеточных животных, например амеб и инфузорий, так как при его осуществлении животные погибают. Наиболее близким к предлагаемому является способ криоконсервирования амеб, согласно которому живые одноклеточные организмы извлекают из среды культивирования и в течение 0,5-1 ч обрабатывают криопротектором. Затем объекты размещают на подложке, алюминиевой фольге, и подвергают медленному ступенчатому замораживанию в жидком азоте со средним градиентом 1 град/мин либо быстрому замораживанию с градиентом 500 град/ мин 2. Однако после размораживания, т. е. извлечения из хладагента и помещения в среду культивирования при 20°С все амебы погибают в течение 10-20 мин. Гибель консервируемых организмов при осуществлении известных способов вызвана повреждением их структуры в результате внутриклеточной кристаллизации воды, а также большой токсичностью криопротекторов. При этом сокращение продолжительности обработки объектов криопротектором (менее 0,5 ч) ускоряет кристаллообразование при замораживании. Увеличение продолжительности обработки криопротектором. свыше I ч, наоборот, усиливает токсическое действие последнего. Цель изобретения - повышение жизнеспособности одноклеточных организмов. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу криоконсервирования живых одноклеточных организмов, включающему извлечение консервируемых объектов из среды культивирования, предварительную инкубацию их при 2-3°С в течение 1,5-2 ч, замораживание с использованием жидкого азота, объекты, подлежащие консервированию обезвоживают путем повыщения концентрации хлористого натрия в среде культивирования до 1 -1,2% и инкубируют в этой среде в течение 5-30 мин, а замораживание осуществляют в течение 0,1-0,2 ссо скоростью (3-10) 1 О град/с в смеси жидкого и твердого азота. Пример 1. Предварительная инактивация объектов путем понижения температуры среды культивирования до 2-3°С и выдерживания их в этих условиях в течение 1,5- 2 ч является наиболее оптимальной для достижения максимальной выживаемости их, что установлено опытным путем. Повышение концентрации NaCl в среде культивирования и выдерживание в ней объектов необходимо для обезвоживания и повыщения вязкости их цитоплазмы. Это принципиально сходно с действием криопротектора, но исключает побочный токсический эффект последнего. Режимы повыщения концентрации NaCl (1,0-1,2%) оптимальны. Такое воздействие в течение 5-30 мин, обеспечивает мягкое частичное обезвоживание объектов без гипертонических повреждений. Последующее сверхбыстрое замораживание объектов осуществляют путем быстрого помещения их в шугообразный азот. Установлено, что оптимальный эффект замораживания достигается при скорости помещения объектов в щугообразный азот в пределах 0,1-0,2 с. При этом режиме помещения объектов градиент скорости замораживания составляет (3-10) 10 град/с. Такой сверхвысокий градиент замораживания обеспечивается низкой температурой щугообразного азота (смеси твердой и жидкой его фаз), равной -215°С, которая значительно ниже температуры жидкого азота, равной - 196°С, а также консистенций щугообразного азота. Опытным путем установлено, что оптимальный эффект соохранения жизнеспособности объектов достигается только в химически чистом шугообразном азоте при оопределенной его плотности. Для достижения этого состояния шугообразного азота давление воздуха в сосуде с жидким азотом понижают до режимов разрежения 1,0-0,1 Па. Разрежение воздуха в сосуде ниже 1,0 Па приводит к затвердению смеси, а выше 0,1. Па - к преобладанию в ней жидкого азота. Необходимая плотность щугообразного азота достигается при содержании в .смеси твердой фазы азота в пределах 55-60%. При разжижении смеси (менее 55% твердой фазы) происходит вскипание азота вокруг объекта, а при ее уплотнении (свыше 60%) возможны механические повреждения объектов.

После сверхбыстрого замораживания объектов консервирование их в течение необходимых сроков осуществляют как в шугообразном, так и в жидком азоте.. При хранении шугообразный азот переходит в жидкое состояние, при этом повышение температур криоконсервирования до -196°С не влияет на выживаемость объектов.

По истечении необходимых сроков консервирования объекты быстро переносят во влажную камеру. Скорость переноса для достижения требуемого градиента размораживания (3-10)- 10 град/с сохраняется равной 0,1-0,2 с. Эти режимы переноса, такие же, как и при замораживании объектов, необходимы для преодоления процесса рекристаллизации внутриклеточной жидкости при ее переходе в жидкое состояние.

Опытным путем установлено, что наилучшая выживаемость объектов достигается при температуре воздуха в камере (25- 27°С), близкой к пределу температурного оптимума их содержания. При таком диапазоне температур и повышенной влажности воздуха в камере (близкой к ) скорость размораживания объектов и условия их перевода в активное состояние оптимальHfe, чем в обычных комнатных условиях при 18-20°С.

Окончательный перевод объектов в среду культивирования осушествляется в течение 5-10 с после размораживания. Режим перевода 5-10 с оптимален, так как выдерживание объектов в камере не менее 5 с необходимо для их температурной акклиматизации к условиям активной жизнедеятельности. Превышение этого срока более 10 с приводит к осушению объектов.

Наиболее удобно осуществлять перевод объектов в среду культивирования путем добавления последней в виде капли к объекту, что установлено опытным путем. При этом превышение объема среды культивирования в 2-3 раза по сравнению с объектом является оптимальным для взаимной стабилизации температур, а также для достижения минимально .необходимых условий активации объектов в этой среде.

Теоретической основой использования эффекта витрификации объектов при исполнении нового способа их сверхбыстрого замораживания является следующее.

При быстром погружении объекта в шугоообразный азот выделяемое им тепло расходуется в основном на плавление твердой фазы смеси. Жидкий азот, получаемый в результате такого расплавления, в свою очередь охлаждается окружающей его шугой. Поэтому он не успевает достичь точки кипения (-196°С) и, соответственно, не образует газового пузыря вокруг объекта. При замораживании объекта в жидком

азоте газовый пузырь, препятствуя теплоотдаче, снижает скорость охлаждения объекта по меньшей мере до 1000- 1500 град/с. При погружении объекта в шугообразный азот скорость его охлаждения максимальна и более постоянна по сравнению с ранее достигнутой. Скорость охлаждения зависит только от величины объекта, находясь в обратной пропорции от нее. Поэтому градиент замораживания (и размораживания) объекта в шугообразном азоте находится в пределах (3-10) X X 10 град/с. Этот градиент установлен с помощью установки - комплекса микротермопары, подключенной к осциллографу

5 с фотоприставкой. Сходную величину градиента, близкую к 6- 10 град/с, удалось получить и теплофизичесйими проверочными расчетами. Такие сверхвысокие скорости изменения температуры объекта превышают верхние пределы скорости кристалло0 образования внутриклеточной воды при прохождении его порога кристаллообразования, равного -(50-70) °С. Поэтому кристаллообразования не происходит и вся внутриклеточная жидкость объекта переходит в гелевое состояние, т. е. происхо5дит, витрификация объекта (переход в стекловидное тело). Сходный механизм сверхбыстрого перехода внутриклеточной жидкости из гелевого состояния в жидкое имеет место и при размораживании объQ екта. Обычного в таких условиях процесса рекристаллизации воды при -(50-70) °С не происходит. Указанные сверхвысокие скорости криоконсервирования могут бцть обеспечены только совокупностью перечисленных операций, производимых в указан5 ной последовательности.

Пример 2. Способ криоконсервирования живых одноклеточных организмов испытывают на лабораторных одноклеточных животных - амебах (Amoeba Proteus) и двух

видах инфузорий (Те1гасЬутепа и Вигsaria). Массовая культура этих животных содержит несколько тысяч особей и находится в среде культивирования объемом 25 мл. Часть особей (около 100 штук амеб, бурсарий либо несколько тысяч тетрахимен) вмес5 те со средой культивирования общим объемом 2 мл отделяют пипеткой Пастера от массовой культуры и помещают в отдельную емкость, например, бюкс, который помещают в холодильник с температурой 2- 3°С на 1,5-2 ч. В- пределах указанных сроков к среде культивирования с объектами добавляют охлажденный до -этой же температуры раствор поваренной соли исходной концентрации 2,2-2,5% и объемом 2 мл. Концентрацию поваренной соли

5 в среде культивирования устанавливают в пределах 1,0-1,. В этих условиях объекты выдерживают в течение 5-30 мин в разных сериях опытов. После этого объ

СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЖИВЫХ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ОРГАНИЗМОВ, включающий извлечение консервируемых объектов из среды культивирования, предварительную инкубацию их при 2-3°С в течение 1,5-2 ч, замораживание с использованием жидкого азота, отличающийся тем, что, с целью повыщения жизнеспособности одноклеточных организмов, объекты, подлежащие консервированию, обезвоживают путем повышения концентрации хлористого натрия в среде культивирования до 1 -1,2% и инкубации в этой среде в течение 5-30 мин, а замораживание осуществляют в течение 0,1 - 0,2 с со скоростью