Криопротектор Советский патент 1987 года по МПК C07C31/22 C07C43/02 A01N1/02 

Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано при низкoтe fflepaтypнoм консервировании биологических объектов, в частности клеток крови, костного мозга и перевиваемых клеточных культур.

Целью изобретения является повьше- ние степени защиты биологических объектов при их низкотемпературном консервировании.

Эта цель достигается п:рименением Л-монометилового эфира глицерина (ШЭГ) формулы

сн. - сн - сн „

( он

он оси.

в качестве криопротектора.

По международной классификации (1961 г.) данное соединение имеет название З-метокси-1,2-пропандиол. 20

Пример 1. Тромбоциты выделяют из донорской крови методом дифференцированного центрифугирования.Крио- защитные среды готовят в виде 10%-ных

Замораживание осуществляют по двз этапной программе: со скоростью I 1 град/мин до минус , вьщержка 3 мин при минус , далее до минус со скоростью 10 град/мин с после дующим погружением в жидкий азот. После I5 сут хранения при азотной

,температуре минус 196°С отогрев проf/..™ водят на водяной бане при АО-С до

исчезновения твердой фазы.

К тромбоконцентрату, содержащему 2 10 клеток/мл, добавляют медленно криозащитные растворы в соотнощении 1:1, так, что конечная концентрация глицерина и ММЭГ быпа 5%.зо

Замораживание осуществляют со скоростью 10 град/мин до минус с последующим погружением в жидкий азот. Деконсервирование проводят путем отогрева н а водяной бане при 37 С.

35

Жизнеспособность клеток костного мозга определяют по методу Шрека. Результаты представлены в табл,2.

В табл. 2 приведены сравнительные данные по криозащитной активности ММЭГ и глицерина при различной конечной концентрации криопротекторов в расчете на исходную концентрацию кле- 2-10

Из табл. 1 видно, что при использовании в качестве криопротектора ММЭГ сохраняется на 40% больше кле

ток, чем в случае применения глицерина, при этом их ретрактильная активность на 20% вьше.

Пример 2. Клеточную взвесь

костного мозга разводят в соотношении 1:1 с МЮГ-и глицерином, приготовленными на дистиллированной воде до конечной концентрации криопротекто- ров 5; 7,5; 15%.

Концентрация клеток, определенная в камере Горяева, составляет 2,06 х

X Ю КЛ/МЛ.

После 15-минутной эквилибрации клеточную взвесь разливают по 1,5 мл в полиэтиленовые контейнеры и запаивают.

Замораживание осуществляют по двз этапной программе: со скоростью I 1 град/мин до минус , вьщержка 3 мин при минус , далее до минус со скоростью 10 град/мин с последующим погружением в жидкий азот. После I5 сут хранения при азотной

зо

35

Жизнеспособность клеток костного мозга определяют по методу Шрека. Результаты представлены в табл,2.

В табл. 2 приведены сравнительные данные по криозащитной активности ММЭГ и глицерина при различной конечной концентрации криопротекторов в расчете на исходную концентрацию кле- 2-10

11400 273 166404580 18120 500 57% 83% 91%

4920±150 112201440 14300+470 25% 56% 71%

Из табл. 2 видно, что при использовании в качестве криопротектора ММЭГ жизнеспособных клеток на 20-30% больше, чем в случае применения глицерина .

Равноценный криозащитньш эффект достигается применением более низких

312

концентраций предлагаемого криопро- тектора. Так, 80% жизнеспособных кле ток, костного мозга цосле замораживания можно получить применением 7,5%- ным раствором МЮГ. тогда как такой же эффект сохранности достигается применением 15%-ного раствора глицерина.

Сравнительное исследование крио- защитной активности глицерина и ММЭГ бьто проведено на перевиваемой культуре клеток почки теленка (ПТ).

Пример 3. Сформировавшийся монослой клеток перевиваемой линии почки теленка в хорошем морфологичес ком состоянии снимают со стекла смесью растворов версена и трипсина в соотношении 9:1. Клеточную взвесь собирают в один сосуд, измеряют ее объем, берут пробу для подсчета кон- центрации клеток в камере Горяева.

К суспензии клеток в соотношении 1:1 при постоянном перемешивании добавляют 20 или 10%-ный раствор ММЭГ или 20%-ный раствор глицерина пита- тельной среде, содержащей: 0,5%-ный гидролизат лактальбумина на растворе Хенкса 45%; среда 199 45%; сьшоротка крупного рогатого скота 10%; канами- цина сульфат 100 мкг/мл. Концентра- 1ЩЯ клеток составляет 2,110 мл.

Затем клеточную суспензию разливают в полиэтиленовые ампулы по 1,5 мл и запаивают.

Эквилибрацию клеток с криозащитной средой бсуществляют в течение 1,5 ч при . Охлаждение проводят в программном замораживателе: на первом этапе со скоростью 1 град/мин до минус , на втором - 5 град/мин до мину 70 С, после чего ампулы с суспензией клеток помещают на хранение в жидкий .азот (минус 196°С).

После 20-дневного хранения осуществляют деконсервацию клеток путем отогрева на водяной бане при 37 С. Размороженные клетки переносят в культу- ральные флаконы, добавляя питательную среду до посевной концентрации клеток (2,). Культивирование осуществляют при 37 °С, производя чеВНИШИ Заказ 857/24 Тираж 372

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

34

рея одни сутки замену среды для удаления криопротектора.

Сохранность клеток оценивают методом суправитального окрашивания 0,2%-ным раствором трипанового синего, а также по динамике и характеру формирования монослоя.

Концентрация клеток культуры ПТ и их жизнеспособность в суспензии, подвергнутой криоконсервации под защитой глицерина и МЮГ, приведена в табл.3.

ТаблицаЗ

Глицерин 10 16,2±1,2 74,0+2,2 10 17,6±0,6 75,011,4 ММЭГ 5 18,0±1,6 82,0±1,1

Р1з данных, представленных в табл. следует, что ММЭГ в меньшей, чем глицерин концентрации оказьшает более выраженный криозащитный эффект в отношении клеток перевиваемой культуры ПТ.

По истечении 4 сут культивировани монослой клетками был выполнен на 100% поверхности культурального сосуда.

Клетки имеют полигональную форму с хорошо выраженными границами, не теряют способности пассироваться. В течение 3 пассажей они без какшс-либо трудностей снимаются со стекла и пересеиваются.

Из приведенных примеров 1-3 следует, что предлагаемый криопротектор ММЭГ обладает более высокой степенью защиты, чем глицерин, при этом он менее токсичен. Формула изобретения

ПрименениеоС -монометилового эфира глицерина в качестве криопротектора.

Подписное

Изобретение касается криобиологии и может быть использовано при низкотемпературном консервировании биологических объектов, в частности клеток крови, костного мозга и перевиваемых клеточных культур. Целью изобретения является повьшение степени защиты биологических объектов при их низкотемпературном консервировании с использованием ы-монометилового эфира глицерина (ММЭГ) в качестве крио- протектора. Тромбоциты донорской крови помещают в криозацитные среды (в виде 10%-ных растворов в плазме) ММЭГ и глицерина (в качестве сравнения). Замораживание осуществляют со скоростью 10 град/мин до минус с по- следукяцим погружением в жидкий азот. Деконсервирование проводят путем отогрева на водяной бане при . При использовании в качестве криопротек- тора ММЭГ сохраняется на 40Z больше клеток, чем в случае применения глицерина, при этом их ретрактильная активность на 20Z выше. 3 .табл. (Л с