Способ получения клеток костного мозга для цитологического исследования Советский патент 1992 года по МПК G01N1/28 A61B10/00 

Изобретение относится к медицине, конкретно к гематологии, и может быть использовано для изучения эндотелиоидных форм гемопоэтических островков в норме и при различных патологических состояниях системы крови (анемии, лейкопении, лейкоцитозы, эритроцитозы, облучение, токсическое воздействие на гемопоэз и др.).

Целью изобретения является получение эндотелиоидных островков.

Способ осуществляют следующим образом.

Костный мозг вместе с костью инкубируют при 37°С в течение 60-90 мин в 0,1- 0,2%-ном растворе коллагеназы, затем инкубируют при 37°С в течение 30-45 мин в 0,2-0,3%-ном растворе трипсина, фиксируют в 0,125%-ном растворе глютарового альдегида 10 мин, механически разбивают его на фрагменты, наслаивают на среду, состоящую из мас.%: фиколл-400 1,9-2,85; диат- риозат натрия 3,0-4,5; верографин 30-45; вода - до 100, центрифугируют при 10001500 об/мин в течение 5-10 мин, собирают интерфазный слой (расположенный над средой и содержащий обогащенную фракцию эндотелиоидных островков) и окрашивают гематологическими красителями.

Пример 1. Бедренную кость мышей линии СВА помещают в 1 мл .0,15%-ного раствора коллагеназы и инкубируют при 37°С в течение 70 мин, переносят в 0,25%- ный раствор трипсина на 40 мин при 37°С, после чего фиксируют в 0,125%-ном растворе глютарового альдегида 10 мин, вымывают содержимое бедренной кости дистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты и наслаивают на среду, состоящую, г: фиколла-400 3,5, диат- риозат натрия 5,0; 50,0 г верографин 50,0; вода - до 100, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин. Затем фрагменты костного мозга, расположенного над указанной средой, собирают и окрашивают ак- ридиновым оранжевым. Анализ морфологического состава ГО показал (таб(Л

С

VI ю

Ј о VJ

лица), что среди них присутствовали только макрофагальныеилйфибробластоидные, но не эндотелиоидные островки.

Пример 2. Бедренную кость мышей линии СВП помещают в 1 мл 0,15%-ного раствора коллагеназы и инкубируют при 37°С в течение 70 мин, переносят в 0,25%- ный раствор трипсина на 40 мин при 37°С, фиксируют в 0,125%-ном растворе глюта- рового альдегида 10 мин, вымывают содержимое костномозгового канала дистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты, наслаивают на среду, состоящую, г: фиколл-400 1,9; диатриозат натрия 3,0; верографин 30,0; вода - до 100, и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин. Затем фрагменты костного мозга, расположенные над указанной средой, собирают и окрашивают акридиновыморанжевым.Анализ морфологического состава ГО показал (таблица, фото), что наряду с макрофагальными и фибробластоидными островками определяется еще один тип ГО-эндотелиоидный.

Пример 3. Бедренную кость мышей линии СВА помещают в 1 мл 0,15%-ного раствора коллагеназы и инкубируют при 37°С в течение 70 мин, переносят в 0,25%- ный раствор трипсина на 40 мин при 37°С, фиксируют в 0,125%-ном растворе глютаро- вого альдегида 10 мин, вымывают содержимоекостномозговогоканаладистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты, которые наслаивают на среду, состоящую, г: фиколл-400 2,5; диатриозат натрия 3,5; верографин 40,0; вода - до 100, и центрифугируют при 1250 об/мин в течение 7 мин. Затем фрагменты костного мозга, расположенные над указанной средой, собирают и окрашивают акридиновым оранжевым. Анализ морфологического состава ГО показал (таблица, фото), что наряду с макрофагальными и фибробластоидными островками определяется еще один тип ГО - эндотелиоидный.

Пример 4. Бедренную кость мышей линии СВА помещают в 1 мл 0,15%-ного раствора коллагеназы и инкубируют при 37°С в течение 70 мин, переносят в 0,25%- ный раствор трипсина на 40 мин при 37°С, фиксируют в 0,125%-ном растворе глютаро- вого альдегида 10 мин, вымывают содержимоекостномозговогоканаладистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты, которые наслаивают на среду, состоящую, г: фиколл-400 2,85; диатриозат натрия 4,5; верографин 45,0; вода - до 100, и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Затем фрагменты костного мозга, расположенные над указанной средой, собирают и окрашивают акридиновым оранжевым. Анализ морфологического состава ГО показал (таблица, фото), что наряду с макрофагальными и фибробластоидными островками определяется еще один тип ГО - эндотелиоидный,

Пример 5. Бедренную кость мышей линии СВП помещают в 1 мл 0,15%-ного раствора коллагеназы и инкубируют при 37°С в течение 70 мин переносят в 0,25%- ный раствор трипсина на 40 мин при

37°С, фиксируют в 0,125%-ном растворе глютарового альдегида 10 мин, вымывают содержимое костномозгового канала дистиллированной водой, разбивают костный мозг на фрагменты, которые наслаивают на среду, состоящую, г: фиколл-400 1,0; диатриозат натрия 2,0; верографин 25,0; вода - до 100, и центрифугируют при 500 об/мин в течение 3 мин. Анализ морфологического состава ГО (таблица) показал, что ни в одном случае эндотелиоидные островки

обнаружены не были.

Предлагаемый способ позволяет получить в неразрушенном виде эндотелиоидные островки, изучить их структуру, исследовать межклеточные взаимосвязи,

определить качественный состав ассоциированных с эндотел.иоидными элементами гемопоэтических островков, что может быть использовано в гематологии для оценки состояния кроветворной ткани в норме и при

различных патологических состояниях (анемии, лейкозы,.лейкопении, токсические повреждения, действие излучения и др.). Формула изобретения Способ получения клеток костного мозга для цитологического исследования путем инкубации костного мозга вместе с костью при 37°С в 0,1-0,2%-ном растворе коллагеназы в течение 60-90 мин, затем в 0,2-0,3%- ном растворе трипсина в течение 30-45 мин,

фиксации в 0,125%-ном растворе глютарового альдегида в течение 10 мин с последующей механической разбивкой и окрашиванием, отличающийся тем, что, с целью получения эндотелиоидных островков, костный мозг после механической разбивки дополнительно наслаивают на среду, состоящую из 1,9-2,85%-ного водного раствора фиколла-400,3,0-4,5%-ного раствора диатриозата натрия и 30-45%-ного

раствора верографина, и центрифугируют при 75-100°С в течение 5-10 мин.

Изобретение относится к медицине, точнее к гематологии. Целью изобретения является выделение эндотелиоидных островков из костного мозга. Для этого костный мозг вместе с костью инкубируют в растворе ферментов, наслаивают на среду, состоящую из фиколла 400, диатриозата натрия, верографина, собирают слой, содержащий фракцию, обогащенную эндотелиоидными клетками, и окрашивают гематологическими красителями.