Способ получения и культивирования гемопоэтических и мезенхимальных стромальных клеток из костномозгового канала трубчатых костей человека Российский патент 2025 года по МПК C12N5/77 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, конкретно к технологиям выделения с последующим культивированием мезенхимальных стромальных и гемопоэтических клеток из костного мозга человека, которое может быть использовано в регенеративной медицине для восстановления поврежденных тканей и органов.

В регенеративной медицине одними из наиболее изученных и перспективных для клинического применения клеток являются мезенхимальные стромальные клетки (МСК). Процессы выделения и культивирования данных клеток относительно просты, но отличаются высокой эффективностью. В настоящее время доказано, что данные клетки обладают способностью стимулировать регенерацию тканей, в тоже время обладают низкой иммуногенностью. Клетки, выделенные из костного мозга на первом этапе обработки, представляют собой гетерогенную популяцию, состоящую из стромальных и гемопоэтических клеток. Поэтому получение двух видов клеток из одной порции костного мозга является экономичным, так как позволяет избежать потерь ценного и важного первичного материала.

Известен способ получения стволовых клеток (патент RU2745040). Получали мезенхимальные стромальные и гемопоэтические клетки из костного мозга ампутированных конечностей (у пациентов с гангреной стопы на фоне сахарного диабета, после ДТП и прочее). Забор проводили в условиях операционной. Из просвета прижизненно ампутированной конечности (например, бедренной кости) при помощи ложки Фолькмана при ампутации на уровне нижней трети части бедра в стерильную емкость извлекали костный мозг, который сразу же транспортировали в лабораторию, где из него в течение 1 часа выделяли гемопоэтические и мезенхимальные стромальные гемопоэтические клетки.

При ампутации на уровне средней или верхней трети части бедра использовали мануальный вакуумный аспиратор. После обработки краев бедренной кости осторожно вводили канюлю через канал полости бедренной кости, не повреждая костный мозг, до костной ткани эпифиза бедренной кости, затем канюлю вытаскивали.

Присоединяли к канюле вакуумный аспиратор и проводили эвакуацию содержимого бедренной кости. Содержимое вакуумного аспиратора переносили в емкость.

Недостатками данного способа являются: взятие костного мозга при ампутации конечностей (у пациентов с гангреной стопы на фоне сахарного диабета, после ДТП и прочее) является неприемлемым, так как материал должен быть взят у здоровых доноров; при такой технологии есть риск свертывания полученного костного мозга без применения антикоагулянта; при использовании вакуумного аспиратора существует возможность контаминации донорского материала. Не описана технология получения МСК и гемопоэтических клеток.

Известен способ получения МСК из подвздошной кости и грудины (патент RU2323252). Пункцию костного мозга проводят в строго стерильных условиях. Полученный пунктат помещают в пробирку с гепарином (100 Ед/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 1-2 часа при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают средой 199 («Sigma», USA) или буфером, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут с последующим получением осадка в ростовой среде. Потом подсчитывают ядросодержащие клетки костного мозга в суспензии и добавляют к осадку ростовую среду. Высевают клетки в дозе 5х10⁴ на 1 см².

При культивировании удаляют среду с продуктами метаболизма клеток вместе с клетками, не относящимися к мезенхимальным стромальным, и заменяют среду на свежую. Культивирование проводят в СО₂-инкубаторе. Пересевы по мере формирования 80% монослоя.

Недостатками данного способа являются: болезненность при пункции подвздошной кости и грудины; при заборе костного мозга данным способом в пунктат не исключено занесение периферической крови, в результате этого выделенная популяция клеток МСК часто бывает гетерогенной; при отстаивания полученного пунктата в пробирке при комнатной температуре в течение 1-2 часа в осадок осаждаются и мезенхимальные стромальные клетки в результате происходит их большая потеря; c помощью данного метода выделяются только мезенхимальные стромальные клетки.

Известен способ получения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга млекопитающих и популяция мезенхимальных стволовых клеток, полученная этим способом (патент RU2303632). Костный мозг получали путем пунктирования из грудины (5-10 мл), или из крыла подвздошной кости таза (15-30 мл) в условиях малой операционной под местной анестезией. Пунктат смешивали с гепарином (500 ЕД) и помещали в стерильный контейнер с герметичной крышкой (объем 25-50мл). 10 мл костного мозга разводили до 30 мл стерильной питательной средой ДМЕМ. Этот образец помещали, не допуская перемешивания, в пробирку с 20 мл подогретого до комнатной температуры (18-23°С) раствором фиколла (плотность 0,077 или 1,115 г/л). Пунктат, наслаивали на фиколл, центрифугировали в течение от 25 до 60 минут при 1000-2000 об/мин., после чего отбирали клеточную фракцию на границе фиколла и верхний слой супернатанта. В результате на границе сред образовалось белое кольцо, представляющее собой моноцитарную фракцию костного мозга, а на поверхности супернатанта находились оставшиеся кусочки костного мозга.

Клеточную суспензию разбавляли эквивалентным или двукратным объемом среды ДМЕМ, содержащей антибиотики (пенициллин 100ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл) и осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 1000 об/мин. Клетки суспендировали в среде ДМЕМ, дополненной 20% фетальной бычьей сыворотки, антибиотиками и снова осаждали центрифугированием в том же режиме. Клеточный осадок и верхний слой супернатанта переносили в посуду для культивирования и покрывали средой культивирования, содержащей ДМЕМ с добавлением 15-22% FBS и антибиотиков. Высев проводили с начальной плотностью 75-200 клеток на см² и помещали в СО₂ инкубатор на 18-52 часа. Затем тщательно отбирали среду культивирования, а клеточную культуру дважды промывали раствором Хенкса и покрывали свежей средой культивирования, подогретой до +37 С. Культуру помещали в СО₂-инкубатор на 56-72 часа, ежедневно наблюдали за ростом культуры; при необходимости, осуществляли замену половины объема кондиционированной среды культивирования на равный объем свежеприготовленной среды. Культуру пересевали с применением раствора трипсина на новую посуду с плотностью 1-2 х10³ клеток на 1 см². Культуру помещали в СО₂ инкубатор на 56-72 часа. Осуществив от 2 до 4 пассажей, получают популяцию клеток, характеризующуюся высокой однородностью по положительным маркерам CD90, CD105, CD106, CD44) - маркерами МСК. Выход составляет до 99,9 % окрашенных клеток.

Недостатками данного способа являются: риск свертывания полученного костного мозга при использовании малого количества гепарина (100 ЕД/мл); при данном методе отсутствует подсчет количества полученных клеток и оценка их жизнеспособности; не указана какая среда была использована при высеве клеток в культуральный флакон; при данном методе указаны большие допуски, например, «на 18-52 часа помещали в инкубатор», «центрифугирование проводили от 25 до 60 минут, при 1000-2000 оборотов»; при данном методе возможно получить только стромальные клетки, а не два вида клеток- стромальных и гемопоэтических.

Данный способ взят нами за прототип.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в получении из пунктата костного мозга двух видов клеток: мезенхимальных стромальных и гемопоэтических.

Способ реализуется следующим образом.

Забор костного мозга проводят в стерильных условиях (операционной) из костномозгового канала кости человека (например, трубчатые кости, гребень подвздошной кости, грудина). Перед забором костного мозга непосредственно в стерильный шприц набирают гепарин из расчета около 1 мл (5000 ЕД) на 20 мл костного мозга. Извлекают костный мозг при помощи иглы для аспирации костного мозга (например, Selective ILY), соединенной с помощью Луер-Лок со шприцом. В процессе извлечения костного мозга важно избегать образования в шприце сгустка костного мозга. Чтобы предотвратить образование сгустков, необходимо неоднократно встряхивать шприц с набранным в него костным мозгом. Все работы с костным мозгом выполняют в строгом соблюдении правил асептики и антисептики. Чтобы гарантировать стерильную доставку первичного материала в лабораторию, костный мозг немедленно переносят из шприца в стерильную емкость, которую герметично закрывают стерильной крышкой и последовательно упаковывают в двойную герметичную стерильную упаковку. На упаковке подписывают время забора и дату; фамилию донора. Материал доставляют в лабораторию культур клеток в течение 1 часа в траспортировочном контейнере; выделение мезенхимальных и гемопоэтических клеток проводят следующим образом: в стерильных условиях при соблюдении правил асептики и антисептики из стерильной траспортировочной емкости извлекается костный мозг и переносится при помощи стерильных пипеток в стерильные емкости для культуральных работ (например, в центрифужные пробирки, количество которых зависит от объема набранного материала), в которых костный мозг разбавляют в соотношении 1:1 буферным раствором PBS без Ca²⁺, Mg²⁺, или DPBS без Ca²⁺, Mg²⁺. Для выделения мононуклеаров из костного мозга в специальные центрифужные пробирки для градиентного центрифугирования (например, SepMate STEMCELL Technologies Inc) вносят градиентную среду плотностью не менее 1,077 г/мл (например, Lymphoprep STEMCELL Technologies Inc; фиколл GE, или Россия) из расчета 1:1, осторожно по стенке наслаивают костный мозг на градиентную среду; пробирку помещают в холодовую центрифугу и центрифугируют при температуре от +4°С до +15°С, скорости вращения от 1100 до 1500 об/мин в течение 15-20 минут; надосадочную жидкость утилизируют; осадок клеток ресуспендируют в питательной среде, например αМЕМ с глютамином (ООО «БиолоТ»), содержащую 8 мкг/мл гентамицина; проводят отмытие клеток от градиентной среды, используя полную ростовую питательную среду (например, αМЕМ с глютамином, 10% FBS (например SC-Biol ООО «БиолоТ»), повторным центрифугированием, с применением холодовой центрифуги (температура от +4°С до +15°С, скорости вращения от 1100 до 1500 об/мин в течение 15-20 минут; надосадочную жидкость утилизируют, в образованный осадок при помощи дозатора вносят 1 мл питательной среды; подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток при помощи автоматических счетчиков клеток, например цифровой счётчик клеток Scepter™ (Merck Millipore, Германия), Luna II (Корея) или камеру Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; высевают клетки в дозе 1х105 жизнеспособных кл/см2 в культуральный флакон и вносят полную ростовую питательную среду; культивирование проводят в СО₂-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО₂ и постоянной влажности; первую смену среды проводят через 48 часов; сливают из флакона кондиционированную культуральную среду, содержащую неприставшие клетки, в том числе гемопоэтические, в стерильную центрифужную пробирку и центрифугируют в холодовой центрифуге при температуре от +4°С до +15°С, скорости вращения от 1100 до 1500 об/мин в течение 15-20 минут; в культуральный флакон с оставшимися прикрепленными ко дну клетками вносят ½ объема свежей среды и ½ объема кондиционированной; после центрифугирования культуральной среды, извлеченной из флакона и содержащей неприставшие клетки, полностью отбирают пипеткой надосадочную среду, а в осадок из клеток вносят полную ростовую питательную среду и переносят во флакон, специально предназначенный для культивирования гемопоэтических клеток; смену среды в обоих культуральных флаконах проводят через 3 суток по аналогичной технологии; по достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя мезенхимальных стромальных клеток проводят пересев клеток из расчета 1:2, при этом возвращают часть кондиционированной среды и добавляют свежую порцию полной ростовой среды в равном объеме. Для доказательства принадлежности клеток к гемопоэтическому и стромальному виду проводят фенотипирование.

Из одного донорского материала одновременно можно получить два вида клеток (мезенхимальных стромальных и гемопоэтических). Повышение жизнеспособности клеток достигается за счет достаточного внесения гепарина, проведение встряхивания шприца с набранным костным мозгом исключает свертывание крови, выход клеток по сравнению с ближайшими способами - аналогами увеличивается в несколько раз. Применение градиентной среды плотностью 1,077 г/мл обеспечивает более качественное разделение фракций. Использование автоматических счетчиков клеток облегчает работу исследователя. Жизнеспособность полученных клеток составляет 99,5%. Режим центрифугирования отрицательного влияния на клеток не оказывает. Использование культуральных флаконов с обработанным дном для адезивных культур обеспечивают прикрепление ко дну только стромальных клеток. Использование флаконов для суспензионных культур обеспечивает культивирование гемопоэтических клеток.

Забор костного мозга проводится у здоровых доноров, что сказывается на качестве полученной культуры. Процесс забора костного мозга происходит в стерильных условиях при соблюдении всех правил асептики и антисептики. Перед забором костного мозга непосредственно в стерильный шприц набирают гепарин из расчета 1 мл (5000 ЕД) на 20 мл костного мозга, что предотвращает свертывание костного мозга, т.е. исключается потеря ценного материала. В процессе забора используется аспирационная игла. Шприц при помощи Луер-Лок соединяют с иглой для аспирации костного мозга, что гарантирует герметичность соединения и исключает потерю материала. Извлекают костный мозг непосредственно в шприц, содержащий гепарин, для исключения контаминации материала, из шприца набранный костный мозг переносят в стерильную емкость, герметично закрывают стерильной крышкой и помещают в двойной стерильный пакет, доставляют в лабораторию культур клеток в течение 1 часа в транспортировочной таре.

Игла для аспирации костного мозга обеспечивает качественный забор материала.

Используются 2 вида культуральных флаконов. В культуральном флаконе специально обработанное дно со сниженной адгезией предназначено для культивирования гемопоэтических клеток. В культуральных флаконах, предназначенных для культивирования стромальных клеток дно специально обработано для повышения адгезии.

Холодовая центрифуга применяется для исключения отрицательных воздействий на клетки в ходе центрифугирования (например, нагрев среды, в которой находятся клетки). Скорость и время вращения центрифуги обеспечивают сохранность клеток и исключает их потерю.

Наиболее оптимальными режимами центрифугирования являются: скорость 1100-1500 об/мин, время от 15 до 20 минут, температура +4 - +15°С.

Кондиционированную среду используют при пересевах в процессе культивирования, добавляя ее к свежей потому, что она содержит физиологически активные продукты жизнедеятельности культивируемых в ней клеток, данная среда оптимизирует пролиферацию клеток в процессе культивирования, обеспечивает накопление клеток в необходимом количестве.

Полученные описанным способом клетки были идентифицированы с помощью культуральных и иммунологических методов. Иммунофенотипирование подтвердило принадлежность полученных клеток к двум разновидностям: гемопоэтическим CD45+, CD34+, CD14+, CD19+ и стромальным CD45-, CD34-, CD14-, CD19-, CD90+, CD105+, CD73+.

Пример 1. Перед забором костного мозга непосредственно в стерильный шприц набирали гепарин в объеме 1 мл (5000 ЕД). Забор костного мозга проводили в стерильных условиях операционной из гребня подвздошных костей в объеме 20 мл. Извлекали костный мозг при помощи иглы для аспирации костного мозга Selective ILY, соединенной с помощью Луер-Лок со шприцом. Чтобы предотвратить образование сгустков, неоднократно встряхивали шприц с набранным в него костным мозгом. Костный мозг немедленно перенесли из шприца в стерильную емкость, которую герметично закрыли стерильной крышкой и последовательно упаковывали в двойную герметичную стерильную упаковку. Материал доставили в лабораторию культур клеток в течение 1 часа в траспортировочном контейнере.

Выделение мезенхимальных и гемопоэтических клеток проводили следующим образом: в стерильных условиях при соблюдении правил асептики и антисептики из стерильной траспортировочной емкости извлекли костный мозг и перенесли при помощи стерильных пипеток в стерильные емкости для культуральных работ, в которых костный мозг разбавляли в соотношении 1:1 буферным раствором PBS без Ca²⁺, Mg²⁺. Для выделения мононуклеаров из костного мозга в специальные центрифужные пробирки для градиентного центрифугирования на 50 мл (SepMate STEMCELL Technologies Inc) вносили градиентную среду плотностью не менее 1,077 г/мл (фиколл, Россия) из расчета 1:1, осторожно по стенке наслаивали костный мозг на градиентную среду; пробирку помещали в холодовую центрифугу и центрифугировали при температуре +4°С, скорости вращения 1500 об/мин в течение 20 минут; надосадочную жидкость утилизировали; осадок клеток ресуспендировали в питательной среде αМЕМ с глютамином (ООО «БиолоТ»), содержащую 8 мкг/мл гентамицина; проводили отмытие клеток от градиентной среды, используя полную ростовую питательную среду αМЕМ с глютамином, 10% FBS, повторным центрифугированием, с применением холодовой центрифуги (+4°С, 1500 об/мин, 20 минут; надосадочную жидкость утилизировали, в образованный осадок при помощи дозатора вносили 1 мл питательной среды; подсчитывали количество выделенных жизнеспособных клеток при помощи автоматического счетчика клеток (Scepter), используя 0,4% раствор трипанового синего; высевали клетки в дозе 1х105 жизнеспособных кл/см2 в культуральный флакон, вносили полную ростовую питательную среду; культивирование проводили в СО₂-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО₂ и постоянной влажности; первую смену среды проводили через 48 часов; сливали кондиционированную культуральную среду из флакона в стерильную центрифужную пробирку и центрифугировали в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1500 об/мин в течение 20 минут); в культуральный флакон с оставшимися прикрепленными ко дну клетками вносили ½ объема свежей среды и ½ объема кондиционированной; после центрифугирования культуральной среды, извлеченной из флакона, отбирали пипеткой надосадочную среду, а в осадок из клеток вносили полную ростовую питательную среду и переносили во флакон для культивирования гемопоэтических клеток; смену среды в обоих культуральных флаконах проводили через 3 суток по аналогичной технологии; по достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя мезенхимальных стромальных клеток проводили пересев клеток из расчета 1:2, при этом возвращали часть кондиционированной среды и добавляли свежую порцию полной ростовой среды в равном объеме. Проведенное фенотипирование показало принадлежность полученных клеток к гемопоэтическому и стромальному виду.

На фиг. 1 изображены гемопоэтические клетки из костного мозга CD45+, CD34+, CD14+, CD19+. На фиг.2 изображены стромальные клетки из костного мозга CD45-, CD34-, CD14-, CD19-, CD90+, CD105+, CD73+.

Пример 2. Перед забором костного мозга непосредственно в стерильный шприц набирали гепарин в объеме 0,3 мл (1500 ЕД). Забор костного мозга проводили в стерильных условиях операционной из костномозгового канала большеберцовой кости в объеме 5 мл. Извлекали костный мозг при помощи иглы для аспирации костного мозга Selective ILY, соединенной с помощью Луер-Лок со шприцом. Чтобы предотвратить образование сгустков, неоднократно встряхивали шприц с набранным в него костным мозгом. Костный мозг немедленно перенесли из шприца в стерильную емкость, которую герметично закрыли стерильной крышкой и последовательно упаковывали в двойную герметичную стерильную упаковку. Материал доставили в лабораторию культур клеток в течение 1 часа в траспортировочном контейнере.

Выделение мезенхимальных и гемопоэтических клеток проводили следующим образом: в стерильных условиях при соблюдении правил асептики и антисептики из стерильной траспортировочной емкости извлекли костный мозг и перенесли при помощи стерильных пипеток в стерильные емкости для культуральных работ, в которых костный мозг разбавляли в соотношении 1:1 буферным раствором PBS без Ca²⁺, Mg²⁺. Для выделения мононуклеаров из костного мозга в специальные центрифужные пробирки для градиентного центрифугирования на 15 мл (SepMate STEMCELL Technologies Inc) вносили градиентную среду плотностью не менее 1,077 г/мл (фиколл, Россия) из расчета 1:1, осторожно по стенке наслаивали костный мозг на градиентную среду; пробирку помещали в холодовую центрифугу и центрифугировали при температуре +15°С, скорости вращения 1500 об/мин в течение 15 минут; надосадочную жидкость утилизировали; осадок клеток ресуспендировали в питательной среде αМЕМ с глютамином (ООО «БиолоТ»), содержащую 8 мкг/мл гентамицина; проводили отмытие клеток от градиентной среды, используя полную ростовую питательную среду αМЕМ с глютамином, 10% FBS, повторным центрифугированием, с применением холодовой центрифуги (+15°С, 1500 об/мин, 15 минут; надосадочную жидкость утилизировали, в образованный осадок при помощи дозатора вносили 1 мл питательной среды; подсчитывали количество выделенных жизнеспособных клеток при помощи автоматического счетчика клеток (Luna II), используя 0,4% раствор трипанового синего; высевали клетки в дозе 1х105 жизнеспособных кл/см2 в культуральный флакон, вносили полную ростовую питательную среду; культивирование проводили в СО₂-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО₂ и постоянной влажности; первую смену среды проводили через 48 часов; сливали кондиционированную культуральную среду из флакона в стерильную центрифужную пробирку и центрифугировали в холодовой центрифуге при температуре +15°С, скорости вращения 1500 об/мин в течение 15 минут); в культуральный флакон с оставшимися прикрепленными ко дну клетками вносили ½ объема свежей среды и ½ объема кондиционированной; после центрифугирования культуральной среды, извлеченной из флакона, отбирали пипеткой надосадочную среду, а в осадок из клеток вносили полную ростовую питательную среду и переносили во флакон для культивирования гемопоэтических клеток; смену среды в обоих культуральных флаконах проводили через 3 суток по аналогичной технологии; по достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя мезенхимальных стромальных клеток проводили пересев клеток из расчета 1:2, при этом возвращали часть кондиционированной среды и добавляли свежую порцию полной ростовой среды в равном объеме. Проведенное фенотипирование показало принадлежность полученных клеток к гемопоэтическому и стромальному виду.

Пример 3. Перед забором костного мозга непосредственно в стерильный шприц набирали в объеме 1 мл (5000 ЕД). Забор костного мозга проводили в стерильных условиях операционной из грудины в объеме 20 мл. Извлекали костный мозг при помощи иглы для аспирации костного мозга (Selective ILY), соединенной с помощью Луер-Лок со шприцом. В процессе извлечения костного мозга неоднократно встряхивали шприц с набранным в него костным мозгом. Материал доставляли в лабораторию культур клеток в течение 1 часа в траспортировочном контейнере; выделение мезенхимальных и гемопоэтических клеток проводили следующим образом: в стерильных условиях при соблюдении правил асептики и антисептики из стерильной траспортировочной емкости извлекали костный мозг и переносили при помощи стерильных пипеток в центрифужные пробирки; в которых костный мозг разбавляли в соотношении 1:1 буферным раствором DPBS без Ca²⁺, Mg²⁺. Для выделения мононуклеаров из костного мозга в специальные центрифужные пробирки для градиентного центрифугирования на 50 мл (SepMate, STEMCELL Technologies Inc) вносили градиентную среду плотностью 1,077 г/мл (Lymphoprep, STEMCELL Technologies Inc) из расчета 1:1, осторожно по стенке наслаивали костный мозг на градиентную среду; пробирку помещали в холодовую центрифугу и центрифугировали при температуре +15°С, скорости вращения 1100 об/мин в течение 15 минут; надосадочную жидкость утилизировали; осадок клеток ресуспендировали в питательной среде αМЕМ с глютамином (ООО «БиолоТ»), содержащую 8 мкг/мл гентамицина; проводили отмытие клеток от градиентной среды, используя полную ростовую питательную среду, повторным центрифугированием с применением холодовой центрифуги (+15°С, 1100 об/мин в течение 15 минут); надосадочную жидкость утилизировали, в образованный осадок при помощи дозатора вносили 1 мл питательной среды; подсчитывали количество выделенных жизнеспособных клеток при помощи камеры Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; высевали клетки в дозе 1х105 жизнеспособных кл/см2 в культуральный флакон и вносили полную ростовую питательную среду; культивирование проводили в СО₂-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО₂ и постоянной влажности; первую смену среды проводили через 48 часов; сливали кондиционированную культуральную среду из флакона в стерильную центрифужную пробирку и центрифугировали в холодовой центрифуге при температуре +15°С, скорости вращения 1100 об/мин в течение 15 минут; в культуральный флакон с оставшимися прикрепленными ко дну клетками вносили ½ объема свежей среды и ½ объема кондиционированной; после центрифугирования культуральной среды, извлеченной из флакона, полностью отбирали пипеткой надосадочную среду, а в осадок из клеток вносили полную ростовую питательную среду и переносили во флакон, специально предназначенный для культивирования гемопоэтических клеток; смену среды в обоих культуральных флаконах проводили через 3 суток по аналогичной технологии; по достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя мезенхимальных стромальных клеток проводили пересев клеток из расчета 1:2, при этом возвращали часть кондиционированной среды и добавляли свежую порцию полной ростовой среды в равном объеме. Проведенное фенотипирование показало принадлежность полученных клеток к гемопоэтическому и стромальному виду.

ИСТОЧНИКИ ЛИТЕРАТУРЫ

[1] Патент RU2323252. Колесникова А.И. СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА EX VIVO.

[2] Патент RU2745040. Николаева Л.П. Способ получения стволовых клеток.

[3] Патент RU2303632. Кругляков П.В., Полынцев Д.Г., Вийде С.К., Кислякова Т.В. Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга млекопитащих и популяция мезенхимальных стволовых клеток, полученная этим способом.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен способ получения и культивирования гемопоэтических и мезенхимальных стромальных клеток, включающий извлечение аспирационной иглой костного мозга в шприц с антикоагулянтом, наслаивание костного мозга в специальной пробирке на градиентную среду, центрифугирование с последующей отмывкой и повторным центрифугированием, подсчет полученных клеток при помощи автоматического счетчика, посев клеток в специально приспособленные культуральные флаконы в соответствии с видом клеток. Предложенный способ позволяет получать из пунктата костного мозга одновременно два вида клеток: мезенхимальные стромальные и гемопоэтические. 2 ил., 3 пр.

Способ получения и культивирования гемопоэтических и мезенхимальных стромальных клеток из костномозгового канала трубчатых костей человека, заключающийся в том, что

с соблюдением правил асептики и антисептики производят забор костного мозга из костномозгового канала непосредственно в стерильный шприц, содержащий гепарин в количестве 1 мл или 5000 ЕД на 20 мл костного мозга, при этом в процессе забора костного мозга шприц неоднократно встряхивают для предотвращения образования сгустков;

костный мозг немедленно переносят из шприца в стерильную емкость, герметично закрывают стерильной крышкой, упаковывают в двойную герметичную стерильную упаковку и доставляют в лабораторию культур клеток в течение 1 ч в траспортировочном контейнере;

полученный костный мозг переносят в стерильные емкости для культуральных работ, в которых костный мозг разбавляют в соотношении 1:1 буферным раствором PBS без Ca²⁺, Mg²⁺, или DPBS без Ca²⁺, Mg²⁺;

для выделения мононуклеаров из костного мозга в специальные центрифужные пробирки для градиентного центрифугирования вносят градиентную среду плотностью не менее 1,077 г/мл из расчета 1:1, осторожно по стенке наслаивают костный мозг на градиентную среду; пробирку помещают в холодовую центрифугу и центрифугируют при температуре от +4 до +15°С, скорости вращения от 1100 до 1500 об/мин в течение 15-20 мин; надосадочную жидкость утилизируют; осадок клеток ресуспендируют в питательной среде αМЕМ с глютамином, содержащей 8 мкг/мл гентамицина; проводят отмытие клеток от градиентной среды, используя полную ростовую питательную среду αМЕМ с глютамином и 10% FBS; повторно центрифугируют с применением холодовой центрифуги при температуре от +4 до +15°С, скорости вращения от 1100 до 1500 об/мин в течение 15-20 мин; надосадочную жидкость утилизируют, в образованный осадок при помощи дозатора вносят 1 мл питательной среды;

подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток при помощи автоматических счетчиков клеток, используя 0,4% раствор трипанового синего;

высевают клетки в дозе 1×10⁵ жизнеспособных кл/см² в культуральный флакон и вносят полную ростовую питательную среду;

культивирование проводят в СО₂-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО₂ и постоянной влажности; первую смену среды проводят через 48 ч;

сливают из флакона кондиционированную культуральную среду, содержащую неприставшие клетки, в том числе гемопоэтические, в стерильную центрифужную пробирку и центрифугируют в холодовой центрифуге при температуре от +4 до +15°С, скорости вращения от 1100 до 1500 об/мин в течение 15-20 мин; в культуральный флакон с оставшимися прикрепленными ко дну клетками вносят ½ объема свежей среды и ½ объема кондиционированной; после центрифугирования культуральной среды, извлеченной из флакона и содержащей неприставшие клетки, полностью отбирают пипеткой надосадочную среду, а в осадок из клеток вносят полную ростовую питательную среду и переносят во флакон, специально предназначенный для культивирования гемопоэтических клеток; смену среды в обоих культуральных флаконах проводят через 3 суток по аналогичной технологии;

по достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя мезенхимальных стромальных клеток проводят пересев клеток из расчета 1:2, при этом возвращают часть кондиционированной среды и добавляют свежую порцию полной ростовой среды в равном объеме.