Способ И.И.Дзержинской прогнозирования течения воспалительного процесса Советский патент 1984 года по МПК A61B10/00 

« Изобретение относится к медицине может быть использовано для пронозирования течения воспалительного процесса. Лейкоциты играют основную роль в противомикробной защите. Дефекты в любом из звеньев антимикробных систем нeйтpoi илoв ведут к заболеваниям характеризующимся частыми повторными инфекциями 1 . Известен способ дифференциальной агностики острых и хронических вос палительных процессов, заключающийся в том, что разработан метод выделени популяции предшественников гранулоцитарного ряда, позволяюпд1й диагност вать острый и хронический воспалител ный процесс 2 . Недостатками способа являются дли тельность исследования,травматичност так как берется пунктат костного моз га. Целью изобретения является сниясен травматичности способа, позволяющего выделить популяттию клеток, отражающую барьерную функцию костного мозга и изучетдае ее диагностической ценности. Поставленная цель достигается тем что согласно способу прогнозирования течения воспалительного процесса путем постановки реакции розеткообразования с нейтрофилами, у пациента берут кровь, наслаивают ее на градиент фиколл-уротраста с плотностью 1,073-1,083 г/мл, далее выделяют фракцию нейтрофилов, инкубируют ее со взятыми в равных частях 2,5%-ным раствором спонтанных эритроцитов и 2,5%-ным раствором комплементарных эритроцитов человека, затем определяют число образовавшихся тотальных Д-нейтрофилов и при увеличении их от носительно нормы в 8-19 раз прогнози руют острый воспалительный процесс, а при увеличении Д-нейтрофилов в 3-7 раз относительно нормы прогнозируют хроническую форму течения воспалительного процесса. Способ осу цествляют следующим образом. У пациента берут кровь, разделение клеток крови производят наслаиванием цельной крови на двойной градиент . 1,070-1,073 И 1,080-1,083 г/мл с последующим центрифугированием при и 1500 об/мин. Получают две чистые.популяции клеток: взвесь лимфоцитов между плазмой и раствором 25 фиколл-уротраста с плотностью I,0701,073 г/мл и взвесь нейтрофилов между двумя растворами с плотностью 1,070-1,073 и 1,080-1,083 г/мл. 0,1 МП нейтрофилов ( клеток к 1 мл) сливают с-0,05 мл раствора спонтанных эритроцитов барана и 0,05 мл 2,5%-ного раствора комплементарных эритроцитов человека. Смесь клеток выдерживают 10-20 мин при 0-4°С. Затем центрифугируют мин. при 0-4 С. Вторую инкубацию проводят в течение 1-2 ч при , центрифигируют при 0-4°С и 1000-1500 об/ мин в течение 10-20 мин, фиксируют 3%-ным раствором глутарового альдегида в фосфатном буфере рН - 7,4 в течение 10-20 мин. Добавляют дистилированной воды и центрифугируют 5-15 мин при 1000-1500 об/мин. Насадок выбрасывают, оставляют 0,1-0,3 мл взвеси клеток, перемешивают и наносят на предметные стекла. Сушат, фиксируют метанолом в течение 510 мин, красят азур-эозином 5-10 мин. В препарате просчитывают 200 клеток о За розеткообразующий Д-нейтрофил считают клетку, присоединившую три спонтанных эритроцита барана и три комплементарных эритроцита чшювека. Вычисляют процентное и абсолютное содержание розеткообразующих клеток. Пример I. Пациент А., здоровый донор. Б силиконированную пробирку на 3 мл смеси фиколл-уротраста плотностью 1,073 г/мл и 3 мл смеси плотностью 1,083 г/мл наслаивают 3 мл крови с последующим центрифугированием при 4С и 1500 об/мин в течение 20 мин. Получают две клеточные взвеси : взвесь лимфоцитов и взвесь нейтрофилов. Взвесь нейтрофилов ЗЮ в 0,1 мл соединяют с 0,05 мл 2,5%-ного раствора спонтанных эритроцитов барана н 0,05 мл 2,5%-ного раствора комплементарных эритроцитов человека. Смесь клеток выдерживают 20 мин при 4с с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 4°С. Вторую инкубацию осуществляют в течение 90 мин. при 4°С. Фиксируют 20 мин 3%-ным раствором глютарового альдегида, центрифугируют, осадок наносят на предметные стекла, сушат, фиксируют метанолом 10 мин, красят азур-эозином в течение 10 мин, считают в 6-7 разных полях зрения в иммерсионной системе микроскопа 200 клеток, присоединяют

не менее 3 ЭБ и 3 ЭЧ. Абсолютное содержание Д-нейтрофилов рассчитывают по формуле

.

N

100 100

где L - количество нейтрофилов в

1 мкл периферической крови; t - нейтрофилы в формуле крови, %; г . - Д-розеткообразующие нейтрофилы, %.

100 100-показатели, приводящие результаты к объему 1 мкл, В иммерсионной системе микроскопа в 7 разных полях 3 % розеткообразуюцих Д-нейтрофилов содержание лейкоцитов в 1 мкл крови 6750, процентное содержание нейтрофилов в формуле крови 60%. Подставив в формулу цифровые значения получим:

-6250:3:60 ,21.5 в 1 мк

100- 100.,

(норма

Пример 2.БольнойХ., история болезни № 2382, поступил в клинику .по поводу фибропластической индураци полового члена. Сопутствующие заболевания - церебральный атеросклероз с явлениями эпилаптоидных приступов сосудистого генеза; остаточные явления полимиэлита,

В силиконированную пробирку на 3 МП раствора фиколл-уротраста плотт костью 1,070 г/мл и 3 мл 1,090 г/мп наслаивают 3 мл крови, центрифугируют в течение 10 мин при и 1000 об/мин, В результате оседают на дно эритроциты, взвесь- лимфоцитов образует кольцо над раствором фиколл уротраста с плотностью 1,070 г/мл, а взвесь нейтрофилов образует кольцо над раствором фиколл-уротраста с пло ностью I,080 г/мл. Нейтрофилы в количестве 310° в 0,1 мл соединяют с 0,05 МО 2,5%-ного раствора спонтанных эритроцитов барана И 0,05 мл 2,5%-ного раствора комплементарнь1х эритроцитов человека. Смесь клеток инкубировали 10 мин при 0°С с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 0°С и 1000 об/мин. Вторую инкубацию осуществляют в течение часа при 0°С. Фиксируют 15 мин 3%-ным раствором глюторового альдеги да с последующим центрифугированием при комнатной температуре в течение 5 мин. Осадок.наносят на предметное стекло, сушат, фиксируют 5 MVUI метанолом, красят азур-эозином в течение 5 мин. Считают в иммерсионной системе микроскопа в 5-7 разных полях 200 нейтрофильных клеток, присоединивших не менее 3 ЭБ и 3 ЭЧ, В данном примере содержание Д-РОН в периферической крови 2425,5 в 1 мкл (35% ), Е-РОП(промиелоциты) 491,4 в 1 мкл (84%), Е-РОМ (миелоциты), 898,5 в мкл (96%) , Е-РОЮ( юных) 804,9 В..1 М1СЛ (86%) , Е.-РОНп( папочкоядерных нейтрофилов) 1467,1 в 1 мк (95%) , Е-РОНс (сегментоядерных нейтрофилов) 245,7 в 1 мкл (98%),

В данном примере морфологические показатели клеточного состава костного мозга в пределах нормы, %: промиелоциты 5,0, миелоциты 8, палочкоядерные нейтрофилы 13,1, сегментоядерные нейтрофилы 21,4,

Костно-мозговой индекс созревания нейтрофилов обозначает отношение молодых гранулоцитарных элементов к зрелым нейтрофилам. В норме он равен 0,6-0,8, В данном примере он в норме и равен 0,6, Содержание клеток нейтрофильного ряда также в норме и составляет 55,6%, Однако сравнение суммы розеткообразующих клеток нейтрофильного ряда в костном мозге и периферической крови показало следующее:

Костный мозг (КК)

1 мкл (воспаление . 5767,В в 1 мкл (норма)

Поздние тотальные Д-нейтрофилы 5д.)-

-121,5 в 1 мкл (норма)

I

У практически здорового человека Е-РОН (в костном

мозге)5788,5 в 1 мкл,

Д-РОН (в периферической крови) 121,5 в 1 мкл. У больного человека : Е-РОН (в костном

могзе)6115,6 в 1 мкл,

Д-РОН (в периферической крови) 2425,5 в 1 мкл. Таким образом, при воспалении изменяется барьерная функция костного мозга и происходит выход популяции нейтрофилов, участвующей в воспалительной реакции. Количество розеткобразующих поздних тотальных Д-нейтрофилов в периферической крови Р iiop в 47 раз меньше, чем розеткообратующих предшественников нейтрофильного ряда в костном могзе. При активной фазе воспаления содержание поздних Д-РОН в периферической крови увеличивается в 19 раз. При купировании процесса эти показатели нормализуются. Пример 3. Больной Н., история болезни № 2056, поступил в клини ку по поводу болезии Пейрони, Показатели крови: лейкоциты.8400 в I мкл сегмеитоядерные нейтрофилы 4032 в 1 мкл (48%) , палочкоядерньш нейтрофилы 252 в } мкл (3%) , эозинофига. 924 в 1 мкл (11%) , лимфоциты 2268 в I мкл (27%) , моноциты 924 в мкл (11%) . В анализе мочи белок 0,093%, лейкоциты 20-30 в поле зрения, солиаксалаты и много слизи.

3 мл периферической крови наелайв ли на 3 мл раствора фиколл-уротраста с плотностью 1,072 г/мл и 3 мп раствора с .плотностью },082 г/мл. Центрифугировали в течение 5 мин при и 1000 об/мин. Б -результате получали две клеточные взвеси: лимфоцитарную .и нейтрофильную. Нейтрофилы в количестве 310 в 0,1 мл соединяли с 0,05 мл 2.5%-ного раствора ЭБ и Oj05 мл 2,5%-ногр раствора ЭЧ. Смесь клеток инкубировали 15 мин при с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 0°С и. 1000 об/мин Вторую инкубацию осуществляли в течение 2 ч при . Фиксируют 20 мин 3%-Hbiis раствором глюторальдегида. :.: Центрифугируют 10 мин при 1000 об/ми осадок наносят на предметные стекла, сушат, фиксируют 7 мин метанолом, красят азур-эозином в течение 7 мин. Счита от в иммерсионной системе микроскопа в 5-7 разных полях 200 Д-нейт рофилов.

В данном примере содержание Д-РОН 378,4 в i мкл (13%), Е-РОП (промиело цитов) 14,7 в 1 шел (78%), Е-РОМ (миелоцитов) 274 в 1 мкл( 87), Е-РО (юных) 277,8 в 1 мкл (63%),Е-РОНп .(палочкоядерных) 816,8 в 1 мкл (59%) Е-РОНс (сегментоядерных) 578 в 1 мкл (37%). В исследуемой периферической крови содержание лейкоцитов 4100 в 1 мкл, сегментоядерных нейтрофилов 2911 в 1 мкл (71%), палочкоядерных нейтро млов 41 в j мкл (1%), эозинофилов 41 в 1 мют (l%)f лимфоцитов 984 в 1 мкл (24%), моноцитов 123 в 1 мкл (3%).

Костный мозг КМ

.1 2 1 1 Н 1 3 ЭУЙ) - п т

- .... ..«.««,«...«.« ..«. я - и J J

5767,8 в 1 мкл (норма) Д-РОН (ПК) 378 4 1дефицит), 121,5 (норма)

У практически здорового человека Е-РОН - 5788,5 в 1 мкл (в костном мозге),

Д-РОН - 121,5 в 1 мкл (в периферической крови).

У больного с хроническим воспалительным процессом:

Е-РОН - 1961,3 в I мкл (в костном мозге),

- 378,4 в 1 мкл (в периферической крови).

Таким образом, при хроническом воспалительном процессе в костном мозге нарушается костно-мозговой индекс созревания нейтрофилов и имеется глубокий дефицит розеткообразующих нейтрофилов. Больной получал антибактериальную и витаминотерапию. После проведенной терапии состояние удовлетворительное, жалоб не температура утром и вечером нормальная. В анализе мочи лейкоциты 2-3

в поле зрения, В моче роста микрофло не обнаруясено.

Пример 4. Больная Р., история болезни № 645, поступила в больТаким образом, все показатели кром ви у больного в пределах нормы. В костном мозге сумма элементов нейтрофильного ряда также в норме и составляет 56,6%. Однако костно-мозговой индекс созревания нейтрофилов значительно ниже нормы и составляет 0,28. Сумма розеткообразующих клеток нейтрофильного ряда в костном мозге в 5 раз меньше, чем в норме: шщус диагнозом хронический пиелонефрит, правосторонний нефроптоз. Болеет в течение 5 лет,. При поступлении жалобы на тупые боли в поясничной области, субфибрильную температуру, елабость. Аналич мочи: уд.вес 1025, реакция кислая, лейкоциты 6-8 в поле зрения, эритроциты 1-2 в поле зрения. В посеве мочи роста микрофлоры не . обнаружено. На рентгенограммах стоя и лежа снижение очистительной функции правой почки с замедпенным выведением препарата из нее. Дефицит суммарной очистительной способности почек 25%,

Способ прогнозирования течения воспалительного процесса путем постановки реакции розеткообразования с нейтрофилами, отличающийся тем, что, с целью снижения травматичности способа, у пациентов берут кровь, наслаивают на градиент фиколлуротраста с плотностью 1,073 - 1,083 г/мл далее выделяют фракцию нейтрофилов, инкубируют ее со взятыми в равных частях 2,5%-ным раствором спонтанных эритроцитов барана и 2,5%-ным раствором комплементарных эритроцитов человека, затем определяют число образо вавшихся тотальных Д-нейтрофилов и при увеличении их относительно нормы в 8-19 раз прогнозируют острый воспалительный процесс, a при увеличении § Д-нейтрофилов t в 3-7 раз относительно нормы прогнозируют хроническую форму течения воспалительного процесса.