Способ определения объема эритроцитов в биологической ткани Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а. именно к нормальной и патологической физиологии сердечно-сосудистой системы, и предназначено для характеристики внутри- органного кровенаполнения при воздействии различных возмущающих факторов.

Известен способ оценки объема эритроцитов в навеске биологической ткани, основанный на способности гемоглобина гемолизатас помощью метгемоглобинобра- зователя (феррицианида) и цианистой соли образовывать цианметгемоглобин, концентрацию которого измеряют фотометрически. После определения количества гемоглобина в заданном объеме эритроцитов крови вычисляют объем эритроцитов в исследуемой ткани.

Однако, при использовании известного способа из-за мутности фотометрируемого раствора (наличие белка в пробе) величина

экстинкции существенно. завышается, что ведет к снижению показателя объема эритроцитов в ткани.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

После забоя животного тушку промораживают при -15°С в течение 3-х ч. Выделенный кусочек органа взвешивают и гомогенизируют в дистиллированной воде в соотношении 1:10. Гемолизат ткани центрифугируют при 6000 об/мин в течение 15 мин.

Параллельно извлекают кровь, которую стабилизируют 5%-ным раствором цитрата натрия и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15 мин. К 0,1 мл эритроцитарной массы добавляют 4,0 мл дистиллированной воды. Гемолизат эритроци 4hO «Ч

О

О

S

ов центрифугируют при 6000 об/мин в теение 15 мин,

В три пробирки вносят по 1,0 мл дистилированной воды, 1,0 мл красителя (70,0- 0,0 мл 20%-ного водного раствора мидопирина, 70,0-80,0 мл 5%-ного водно- о раствора анилина сернокислого и 96%- ного этилового спирта до 500,0 мл) и 0,8 мл %-ной перекиси водорода. В первую пробирку добавляют 0,2 мл супернатанта ткани, во вторую - 0,2 мл супернатанта эритроциов крови, а в третью - 0,2 мл дистиллированной воды (контроль на реактивы). Содержимое первых 2-х пробирок перемешивают и центрифугируют при 6000 об/мин в течение 5 мин.

Через 15 мин после прибавления красителя пробы спектрофотометрируют при дли- не волны 540 нм. Длина оптического пути кювет 10 мм;

Объем эритроцитов в биологической ткани рассчитывают по формуле

(Етк - Ек) х 5 х 1000

(Еэр-Ек)х2

где V - объем эритроцитов в ткани, мкл/г;

Етк - экстинкция пробы ткани;

Еэр - экстинкция пробы эритроцитов крови;

Ек - экстинкция пробы контроля на реактивы;

5 - объем эритроцитов крови в пробе, мкл;

2 - масса ткани в пробе, мг;

1000 - коэффициент пересчета из мг в г.

П р и м е р 1. У белой беспородной крысы - самца массой 130 г после забоя передозировкой эфирного наркоза и промораживания тушки в морозильной камере холодильника при -15°С в течение 3-х ч взяты для анализа навески следующих органов: печени (массой 95 мг), почки (массой 60 мг), селезенки (массой 65 мг) больших полушарий мозга (массой 70 мг).

Обработка биологической ткани и крови проведена по предлагаемому способу. Состав красителя, мл: 20%-ный водный раствор амидопирина 70,0; 5%-ный водный раствор анилина сернокислого 70,0; 96%- ный этиловый спирт до 500,0.

Результаты измерения экстинкции проб:

Печень 0,452; Етк-Ек 0,422;

Почка 0,207; Етк-Ек 0,177;

Селезенка 0,219; ,189;

Большие полушария мозга 0,073; Етк-Ек 0,043;

Эритроциты крови 2,480; ЕЭр-Ек 2,450;

Контроль 0,030.

ИсходяизформулыV

(Етк-Ек)х 5x1000 к -тс с о объем эритроцитов

Сзр - Ск) X i

составляет, мкл/г: в печени 430,6; в почке 180,6; в селезенке 192,9; в больших полушариях мозга 43,9.

Пример 2. У белой беспородной крысы - самца массой 200 г после забоя передози: ровкой эфирного наркоза и проморажива- ния тушки в морозильной камере холодильника при -15С в течение 3-х ч взяты для анализа навески следующих органов: печени (массой 80 мг), почки (массой 65 мг), селезенки (массой 90 мг), больших 5 полушарий мозга (массой 60 мг),

Обработка биологической ткани и крови проводилась по предлагаемому способу. Состав красителя, мл: 20%-ный водный раствор амидопирина 75,0; 5%-ный водный 0 раствор анилина сернокислого 75,0; 96%- ный этиловый спирт до 500,0 мл.

Результаты измерения экстинкции проб: Печень 0,426; Етк-Ек 0,402; Почка 0,213; Етк-Ек 0,189; 5 Селезенка 0,207; ЕТК-ЕК 0,183;

Большие полушария мозга 0,064; Етк- . ,040;

Эритроциты крови 2,252; ЕЭр-Ек 2,228; Контроль 0,024. 0 Исходя из формулы V

(Етк -Ек)х 5x1000 к

л-ТЕ объем эритроцитов

(сэр Ек) х 2.

составляет, мкл/г: в печени 451,1; в почке 212,1; в селезенке 205,3; в больших полуша- 5 риях мозга 44,9,

Пример-3. У белой беспородной крысы-самца массой 150 г после забоя передозировкой эфирного наркоза и промора- 0 живания тушки в морозильной камере холодильника при -15°С в течение 3-х ч взяты для анализа навески следующих органов: печени (массой 60 мг), почки (массой 60 мг), селезенки (массой 85 мг), больших полуша- 5 рий мозга (массой 70 мг).

Обработка биологической ткани и крови проводилась по предлагаемому способу. Состав красителя, мл: 20%-ный водный раствор амидопирина 80,0; 5%-ный водный 0 раствор анилина сернокислого 80,0; 96%- ный этиловый спирт до 500,0 мл.

Результаты измерения экстинкции проб:

Печень 0,439; ЕТК-ЕК 0,412;

Почка 0,227; ЕТК-ЕК 0,200; 5 Селезенка 0,216; Етк-Ек 0,189;

Большие полушария мозга 0,078; Етк- -Ей-0,051;

Эритроциты крови 2,520; Етк-Ек 2,493;

Контроль 0,027.

Исходя из формулы V

(Етк-Ек)х 5x1000 объем эритроцитов

{.Ьэр Ьк) X i

составляет, мкл/r: в печени 413,2; в почке 200,6; в селезенке 189,5; в больших полушариях мозга 51,1.

При использовании предлагаемого красителя в предлагаемом способе после повторного центрифугирования проб и удаления осадка фотометрируемый раствор оказывается прозрачным. В результате становится возможным точное измерение концентрации гемоглобина в пробе, что делает более объективным и информативным способ определения объема эритроцитов в навеске биологической ткани. Способ прост в исполнении, не требует высокотоксичных и дефицитных реактивов, а также дорогоскх- ящего оборудования. Он может с успехом использоваться при изучении состояния регионарного кровенаполнения сосудов в условиях нормы и патологии, при действии различных вазоактивных препаратов.

Формула изобретения Способ определения объема эритроцитов в биологической ткани путем гемолиза эритроцитов, центрифугирования, окраши0

5

вания гемолизата с последующим измерением экстинкции пробы ткани против контроля, отл ича ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, производят повторное центрифугирование после окрашивания гемолизата, в качестве красителя используют смесь, состоящую из 20%-ного амидопирина, 5%-ного анилина сернокислого, 96%-ного этилового спирта, при следующих соотношениях компонентов, мае. %:

Раствор амидопирина14-16

Раствор анилина

сернокислого14-16

Этиловый спиртОстальное,

а объем эритроцитов определяют по формуле

20

V

К (Етк - Ек) (Еэр-Ек).

где V - объем эритроцитов в ткани, мкл/г;

Етк - экстинкция проб ткани;

Еэр - экстинкция пробы эритроцитов крови;

Ек - экстинкция пробы контроля на реактивы;

К - постоянный коэффициент.

Использование: для определения объема эритроцитов и исследования функции внутриорганных сосудов при действии различных экстремальных факторов. Сущность изобретения: после окрашивания гемолиза- та производят повторное центрифугирование, в качестве красителя используют смесь, состоящую из амидопирина, анилина сернокислого и этилового спирта, объем эритроцитов в тканях определяют по формуле (Етк-Ек)/(ЕЭр-Ек), где V - объем эритроцитов в ткани, мкл/г; Етк - экстинкция пробы ткани; ЕЭр экстинкция пробы эритроцитов крови; Ек - экстинкция пробы контроля на реактивы; К - постоянный коэффициент. . ,