СПОСОБ В.Г.МАЛЫШЕВА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА КРОВИ В ПОРЦИИ МОЧИ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине и предназначено для оценки степени гематурии в определенный временной интервал физиологического и патологического процесса в организме.

Известны способы определения степени гематурии по количеству эритроцитов в осадке мочи, подсчитанному в счетной камере под светооптическим микроскопом. Однако при исследовании осадка мочи невозможно соблюсти постоянство объема препарата, учесть точно количество мочи, из которой получен осадок и его объем. При этом не учитываются также условия центрифугирования, площадь поля зрения препарата. В.Е.Предтеченский /1959/ указывал, что при обычном исследовании осадка мочи выразить числом количество форменных элементов крови означает "симулировать точность". Ввиду этого, по независящим от исследователя причинам, можно получить нормальные показатели количества клеток при патологических процессах в почках и, наоборот, повышенное число их при отсутствии почечной патологии. Естественно, что таким способом у одного и того же больного, в одно и то же время можно получить данные, противоречащие представлению о динамике болезни. Клинические наблюдения показывают, что во время или сразу же после появления крови в моче часть эритроцитов лизируется вследствие их механической травмы или несоответствия физико-химических параметров этих клеток условиям окружающей среды. /А.З. Нечипоренко, 1961/.

В связи с этим большое практическое значение приобретают химические способы определения степени гематурии.

Для этой цели используются хорошо известные методы Адлера и Вебера. Они основаны на способности гемоглобина, облада- ющего пероксидазной активностью, разлагать перекись водорода. В результате образуется атомарный кислород, который окисляет реактив /бензидин или гваяковую смолу/ с появлением окрашенного продукта. Интенсивность окраски последнего будет отражать концентрацию гемоглобина в пробе - показателя содержания в ней крови.

Метод Адлера: К 2 мл мочи добавляют щепотку чистого бензидина и 10-15 капель ледяной уксусной кислоты. Энергично встряхивают, затем добавляют несколько капель перекиси водорода 12%. В присутствии гемоглобина появляется окраска, переходящая от зеленого к синему цвету.

Метод Вебера: К 5 мл мочи со слабокислой реакцией /в случае необходимости подкисляют ледяной уксусной кислотой/ или эфирного экстракта мочи добавляют 2 мл 12% перекиси водорода, затем 5-10 капель 2% свежего спиртового раствора гваяковой смолы. В присутствии гемоглобина раствор окрашивается в темно-синий цвет.

Однако эти методы имеют существенные недостатки, поскольку могут дать лишь качественную характеристику крови в моче без учета объема мочи, выделенной больным в данный отрезок времени.

В то же время по наличию лишь крови в моче и визуальной оценке интенсивности окрашивания растворов невозможно точно охарактеризовать степень гематурии, т.е. оценить выраженность процесса поступления крови в мочу при различных состояниях организма.

С другой стороны, показатели содержания крови в моче, собранной в течение 12-24 ч, не позволяют проследить за динамикой патологического процесса, особенно на ранних сроках заболевания, когда наиболее эффективна диагностика и лечение его. Исследование мочи в указанный временной интервал требует тщательного контроля за сбором и хранением ее в холодильнике. По мнению Houghton, Pears /1957/ в случае хранения мочи в течение суток даже при низкой температуре наблюдается выраженный лизис эритроцитов. При стоянии мочи гемоглобин превращается в метгемоглобин, который не обладает пероксидазной активностью и дает отрицательные результаты /И.Тодоров, 1963/. Таким образом, исследование большой порции мочи, собранной в течение относительно длительного интервала времени, наряду с низкой диагностической ценностью увеличивает методические артефакты. Это ограничивает использование метода определения количества крови в моче в широкой клинической практике.

При выходе большого количества крови в мочу, что нередко наблюдается в клинических условиях, возникает так называемое постгеморрагическое состояние организма. Оно характеризуется в первую очередь наличием более или менее выраженной гипохромной анемии с уменьшением цветного показателя ниже 0,9. В случае гипохромной анемии показатели концентрации гемоглобина в моче будут отражать больший объем крови в ней по сравнению с нормохромной анемией. Следовательно, для точного определения количества крови в моче необходима информация о концентрации гемоглобина в определенном объеме периферической крови /ПК/, которую желательно (для уменьшения методических артефактов) оценить тем же методом, что и в моче. Имея указанный параметр и зная концентрацию гемоглобина в пробе мочи, можно легко перерассчитать на количество крови в исследуемой порции мочи. Однако этап определения концентрации гемоглобина в определенном объеме ПК в прототипных способах не предусмотрен.

Кроме того, степень окисления бензидина и гваяковой смолы, используемые в прототипных способах, во многом зависит от временных параметров. Так, наблюдения показывают, что уже с первых минут после прибавления соответствующего красителя, оптическая плотность окрашенного раствора существенно изменяется и не стабилизируется даже через 30-40 мин, когда начинает изменяться цвет окраски, что требует изменения длины волны фотометрирования проб. Следовательно, применение бензидина и гваяковой смолы для количественного определения крови в моче не целесообразно из-за нестабильности окрашенного раствора во времени.

Таким образом, для повышения точности способа определения количества крови в моче с целью увеличения диагностической и прогностической ценности ее по сравнению с прототипами необходимо:
- иметь подходы, позволяющие с помощью приборов (количественно) охарактеризовать концентрацию гемоглобина в пробе;
- чтобы краситель для выявления гемоглобина давал стабильную в регистрируемый временной интервал оптическую плотность раствора, предназначенного для фотометрии. При этом показатели оптической плотности окрашенного раствора должны быть пропорциональны концентрации гемоглобина в пробе, что достигается высокой специфичностью красителя по отношению к окрашиваемому веществу (гемоглобину);
- концентрацию гемоглобина оценивать одновременно в определенной порции мочи и ПК с последующим перерасчетом на количество крови в моче;
- для анализа брать мочу, полученную в интересуемый исследователя временной интервал физиологического или патологического процесса, желательно более короткий. При этом необходимо знать объем полученной мочи, для того чтобы оценить количество крови, поступившей в мочу в единицу времени (мин);
- для анализа использовать свежесобранную мочу.

Всем этим требованиям соответствует заявляемый способ, где и реализуется цель изобретения - повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Берут одноразовую порцию мочи, полученную за определенный, желательно более короткий промежуток времени (например за 3 ч). Измеряют объем выпущенной мочи.

В этот временной интервал извлекают кровь из пальца в количестве 0,2-0,3 мл, которую выдувают в пробирку с 5%-ным раствором цитрата натрия (соотношение крови и реактива должно быть 4:1). Берут цитратную кровь в количестве, которое соответствует 0,1 мл цельной крови, и прибавляют к 4 мл дистиллированной воды. Пробу встряхивают до образования прозрачного гемолизата.

К 2 мл свежесобранной мочи добавляют 0,01 мл 50%-ного раствора уксусной кислоты и 3 мл диэтилового эфира. Пробы встряхивают в течение 2-3 мин (не допускать разбрызгивания эфирного экстракта 4) и затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин.

В три пробирки наливают по 1,5 мл красителя (70 мл 20%-ного водного раствора амидопирина, 70 мл 5%-ного водного раствора анилина сернокислого и 96^о-ный этиловый спирт до 500 мл) и 1,5 мл 12%-ной перекиси водорода (готовится из пергидроля). В первую пробирку добавляют весь эфирный экстракт, находящийся над слоем мочи, во вторую - 0,2 мл гемолизата ПК, в третью - 0,2 мл дистиллированной воды. Содержимое пробирок перемешивают и через 10 мин от начала реакции с красителем спектрофотометрируют при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см.

Количество крови рассчитывают в минутном объеме мочи по формуле:
H= , где Н - количество крови в минутном объеме мочи (мкл/мл˙мин);
Е_м - экстинкция пробы мочи;
Е_кр - экстинкция пробы ПК;
Е_к - экстинкция холостой пробы;
5 - объем ПК в пробе (мкл);
2 - объем мочи, взятой для анализа (мл);
Y - объем мочи, собранной за конкретный отрезок времени (мл);
Т - время собирания мочи (мин).

Заявляемый способ успешно применен для оценки количества крови в порции мочи 23 больных с различной патологией урогенитальной системы (острые и хронические нефриты, травма почек, циститы, эрозия шейки матки).

Специфичность заявляемого способа оценивалась после следующих исследований.

Лиофилизированный гемоглобин (фирма "Реанал") растворяли в дистиллированной воде в концентрации 5 мг/мл.

На фиг.1 показана зависимость величины экстинкции окрашенного стандартного раствора гемоглобина от его концентрации в пробе (по предлагаемому способу). Кривая прямолинейна.

В пять пробирок наливали по 2 мл дистиллированной воды. В первую пробирку прибавляли 0,04 мл, во вторую - 0,08 мл, в третью - 0,12 мл, в четвертую - 0,16 мл и в пятую 0,20 мл раствора гемоглобина, что соответствует 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 мл гемоглобина в пробе. Во все пробирки добавляли по 3 мл диэтилового эфира. Пробы встряхивали в течение 2 мин и затем центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин.

В пять пробирок наливали по 1,5 мл используемого красителя и 1,5 мл 12% -ной перекиси водорода. В соответствующие пробирки добавляли эфирный экстракт, находящийся над слоем мочи. Содержимое пробирок перемешивали и через 10 мин от начала окрашивания фотометрировали на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм против дистиллированной воды. Длина оптического пути кювет 1 см.

Результаты измерения экстинкции проб:
Е₁ - 0,427;
Е₂ - 1,024;
Е₃ - 1,415;
Е₄ - 1,860;
Е₅ - 2,330.

Калибровочная кривая, построенная по стандартному раствору гемоглобина (фиг. 1) показала прямо пропорциональную зависимость между концентрацией гемоглобина в пробе и оптической плотностью окрашенного раствора.

В дальнейшем необходимо было установить характер зависимости величины оптической плотности окрашенного раствора от количества взятой крови.

Для этого извлекали кровь из пальца в количестве 0,2 мл, которую выдували в пробирку с 0,05 мл 5%-ного раствора цитрата натрия. К 4 мл дистиллированной воды добавляли 0,13 мл цитратной крови (это соответствует 0,1 мл цельной крови). Пробы встряхивали до образования прозрачного гемолизата.

На фиг.2 показана зависимость величины экстинкции окрашенного раствора гемолизата от объема взятой ПК (по предлагаемому способу). Кривая прямолинейна.

В пять пробирок наливали по 2 мл дистиллированной воды. В первую пробирку прибавляли 0,04 мл, во вторую - 0,08 мл, в третью - 0,12 мл, в четвертую - 0,16; в пятую - 0,20 мл гемолизата, что соответствует 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 мкл крови в пробе. Во все пробирки добавляли по 3 мл диэтилового эфира. Пробы встряхивали в течение 2 мин и затем центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин.

В пять пробирок наливали по 1,5 мл используемого красителя и 1,5 мл 12% -ной перекиси водорода. В соответствующие пробирки добавляли эфирный экстракт, находящийся над слоем мочи. Содержимое пробирок перемешивали и через 10 мин от начала окрашивания фотометрировали на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм против дистиллированной воды. Длина оптического пути кювет 1 см.

Результаты измерения экстинкции проб:
Е₁ - 0,418;
Е₂ - 0,965;
Е₃ - 1,423;
Е₄ - 1,832;
Е₅ - 2,300.

Кривая зависимости величины оптической плотности окрашенного раствора от объема взятой крови также оказалась прямолинейной (фиг.2).

Воспроизводимость заявляемого способа оценивалась по способу добавки.

В делительную воронку наливали 10 мл мочи здорового испытуемого, куда добавляли 0,05 мл 50%-ного раствора уксусной кислоты и 10 мл диэтилового эфира. Пробы встряхивали в течение 3 мин и затем центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин. Эфирный экстракт удаляли.

В пять пробирок наливали по 2,0 мл очищенной таким способом мочи. В первую пробирку прибавляли 0,01 мл, во вторую - 0,02 мл, в третью - 0,03 мл, в четвертую - 0,04 мл и в пятую - 0,05 мл цельной крови (эти объемы получены путем перерасчета соответствующих объемов взятой цитратной крови). Затем в каждую пробирку добавляли по 3 мл диэтилового эфира, пробы встряхивали в течение 2 мин и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин.

Цитратную кровь, соответствующую количеству 0,1 мл цельной крови, прибавляли к 4 мл дистиллированной воды. Пробу встряхивали до образования прозрачного гемолизата.

В семь пробирок наливали по 1,5 мл используемого красителя и 1,5 мл 12% -ной перекиси водорода. В пять из них добавляли соответствующий эфирный экстракт, находящийся над слоем мочи, в шестую - 0,2 мл гемолизата ПК и в седьмую - 0,2 мл дистиллированной воды. Содержимое пробирок перемешивали через 10 мин от начала окрашивания фотометрировали на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм против дистиллированной воды. Длина оптического пути кювет 1 см.

Результаты измерения экстинции проб:
E₁ - 3,526;
E₂ - 6,830;
E₃ - 11,540;
E₄ - 13,672;
E₅ - 19,024;
E₆ - 1,780;
E₇ - 0,022.

а/ Начальное разведение крови - 100 мкл в 4,0 мл дистиллированной воды. В опыт брали 0,2 мл гемолизата крови, объем которого соответствует х (мкл) крови. Отсюда:
100 мкл - 4,0 мл
х - 0,2 мл х=5,0 мкл крови.

б/ Объем крови:
- в первой пробе мочи -
1,780 - 5,0 мкл
3,526 - х х=9,9 мкл;
процентная разница от истинного значения -
10,0 - 100%
9,9 - х₁ х₁=99% /-1%/.

- во второй пробе мочи -
1,780 - 5,0 мкл
6,830 - х х=19,2 мкл;
процентная разница от истинного значения -
20,0 - 100%
19,2 - х₁ х₁=96% /-4%/.

- в третьей пробе мочи -
1,780 - 5,0 мкл
11,540 - х х=32,4 мкл;
процентная разница от истинного значения -
30,0 - 100%
32,4 - х₁ х₁=108% /+8%/.

- в четвертой пробе мочи -
1,780 - 5,0 мкл
13,672 - х х=38,4 мкл;
процентная разница от истинного значения -
40,0 - 100%
38,4 - х₁ х₁=96% /-4%/.

- в пятой пробе мочи -
1,780 - 5,0 мкл
19,024 - х х=53,4 мкл;
процентная разница от истинного значения -
50,0 - 100%
53,4 - х₁ х₁=107% /+7%/.

Таким образом, погрешность заявляемого способа при анализе 5 проб мочи с известным объемом крови не превышает 10%, что вполне допустимо для клинических лабораторных методов (В.В.Меньшиков, 1987).

Чувствительность заявляемого способа оценивалась исходя из пороговых значений экстинкции проб мочи с известным количеством добавленной ПК (способ добавки - см. выше). В порцию очищенной диэтиловым эфиром мочи добавляли соответствующее количество гемолизата, полученного после прибавления 0,1 мл (100 мкл) цельной крови (этот объем получен путем перерасчета из соответствующего количества взятой цитратной крови) и 20 мл дистиллированной воды. Пробу встряхивали до образования прозрачного гемолизата. Объем цельной Величина крови в пробе экстинкции мочи, мкл проб 3,0 1,090 2,0 0,705 1,0 0,384 0,8 0,280 0,6 0,208 0,4 0,126 0,2 0,075 0,15 0,037 0,10 0,040 0,05 0,032
Таким образом, пороговая величина экстинкции, характеризующая чувствительность способа, по результатам исследований составляет 0,075, что соответствует 0,2 мкл крови в моче.

Оптическую плотность одной из указанных проб (4-я проба) измеряли в различный временной интервал после прибавления красителя.

Результаты измерения экстинкции пробы:
через 2 мин - 0,094;
через 4 мин - 0,190;
через 6 мин - 0,245;
через 8 мин - 0,278;
через 10 мин - 0,280;
через 12 мин - 0,275;
через 14 мин - 0,272;
через 16 мин - 0,294;
через 18 мин - 0,256; изменился цвет окраски
через 20 мин - 0,218.

Исходя из полученных данных, интервал времени, когда регистрируется стабильная оптическая плотность пробы в условиях сохранения цвета их окраски, составлял 8-24 мин. Этим руководствовались при выборе срока измерения экстинкции проб мочи после прибавления красителя (через 10 мин).

Воспроизводимость результатов оценивалась путем сопоставления величин экстинкции обработанных заявляемым способом 10 проб мочи одинакового объема, взятой у одного больного.

Результаты измерения экстинкции проб:
E₁ - 0,368;
E₂ - 0,376;
E₃ - 0,350;
E₄ - 0,352;
E₅ - 0,398;
E₆ - 0,355;
E₇ - 0,370;
E₈ - 0,370;
E₉ - 0,354;
E₁₀ - 0,372.

Отсюда: среднее арифметическое /М/=0,367;
среднеквадратическое отклонение / σ/=0,014;
Y = × 100%, где Y - коэффициент вариации.

Y = × 100 = 3,8%.

Вывод формулы для расчета количества крови в моче.

Исходные данные:
Объем мочи, выделенной за 3 ч /У/ - 120 мл;
Объем взятой для анализа мочи - 2 мл;
Объем взятого для анализа гемолизата ПК - 0,2 мл;
Экстинкция пробы мочи /Е_М/ - 0,350;
Экстинкция пробы ПК /Е_кр/ - 1,740;
Экстинкция холостой пробы /E_к/ - 0,028;
а/ Начальное разведение ПК - 0,1 мл в 4 мл дистиллированной воды. В опыт берут 0,2 мл гемолизата, объем которого соответствует х (мкл) крови. Отсюда:
100 мкл - 4,0 мл
х - 0,2 мл
х=5,0 мкл крови.

б/ Объем крови в пробе мочи:
/E_м-E_к/=0,322
/E_кр-E_к/=1,712
Отсюда:
1,712 - 5,0 мкл
0,322- х
х=0,94 мкл.

в/ Количество мочи, выделенной за 1 мин:
120 мл - 180 мин
х - 1 мин
х=0,67 мл.

г/ Количество крови в минутном объеме мочи:
2,0 мл - 0,94 мкл
0,67 мл - х
х=0,31 мкл/мл˙мин.

В окончательном варианте получается формула:
H= =
Н=0,31 мкл/мл˙мин.

Исходные данные:
Объем мочи, выделенной за 3 ч /Y/ - 165 мл;
Объем взятой для анализа мочи - 2 мл;
Объем взятого для анализа гемолизата ПК - 0,2 мл;
Экстинкция пробы мочи /Е_м/ - 0,158;
Экстинкция пробы ПК /E_кр/ - 1,824;
Экстинкция холостой пробы /E_к/ - 0,020.

a/ Начальное разведение ПК - 0,1 мл в 4 мл дистиллированной воды. В опыт берут 0,2 мл гемолизата, объем которого соответствует х (мкл) крови. Отсюда:
100 мкл - 4,0 мл
х - 0,2 мл
х = 5,0 мкл крови.

б/ Объем крови в пробе мочи:
/E_м-E_к/=0,138;
/E_кр-E_к/=1,804
Отсюда:
1,804 - 5,0 мкл
0,138 - х
х=0,38 мкл.

в/ Количество мочи, выделенной за 1 мин:
165 мл - 180 мин
х - 1 мин
х=0,92 мл.

г/ Количество крови в минутном объеме мочи:
2,0 мл - 0,38 мкл
0,92 мл - х
х=0,18 мкл/мл˙мин.

На основании выведенной формулы получается аналогичный результат:
^H==
H=0,18 мкл/мл˙мин.

Исходя из приведенной формулы, 5/2 - величина постоянная, поэтому мы обозначили ее постоянным коэффициентом /K/.

Отсюда:
H= K , где Н - количество крови в минутном объеме мочи (мкл/мл.мин);
Е_м - экстинкция пробы мочи;
Е_кр - экстинкция пробы ПК;
Е_к - экстинкция холостой пробы;
Y - объем мочи, собранной за конкретный отрезок времени (мл);
Т - время собирания мочи (мин);
К - постоянный коэффициент.

В таком варианте формула расчета количества крови в порции мочи и представлена в формуле изобретения.

П р и м е р 1. Больной С., 61 года. Диагноз: хронический гломерулонефрит. Объем мочи, выделенной за 2 ч - 95 мл.

Количество крови в моче определяли предлагаемым способом.

Результаты измерения экстинкции проб:
Проба мочи /E_м/ - 0,958;
Проба ПК /E_кр/ - 1,685;
Холостая проба /E_к/ - 0,024.

Отсюда:
^H==
H=1,11 мкл/мл.мин.

П р и м е р 2. Больной К., 56 лет. Диагноз: тупая правосторонняя травма почки. Объем мочи, выделенной за 3 ч - 110 мл.

Количество крови в моче определяли предлагаемым способом.

Результаты измерения экстинкции проб:
Прба мочи /E_м/ - 0,620;
Проба ПК /E_кр/ - 1,846;
Холостая проба /E_к/ - 0,020.

Отсюда:
^H==
H=0,50 мкл/мл˙мин.

Таким образом, создан простой в исполнении и в то же время специфичный, хорошо воспроизводимый и достаточно чувствительный способ определения количества крови в порции мочи. По сравнению с прототипом в нем учитываются объем мочи, собранной в интересуемый отрезок времени, время собирания мочи, а также объем мочи, взятой для анализа. При этом для анализа используется свежесобранная моча, где, по данным литературы, не содержится метгемоглобина (не обладающего пероксидазной активностью), ускоренное образование которого из гемоглобина отмечается при относительно длительном хранении мочи. В заявляемом способе используется специфичный для гемоглобина краситель, который дает стабильную величину оптической плотности окрашенного раствора в регистрируемый отрезок времени. Одновременное определение концентрации гемоглобина в известном объеме мочи и ПК позволяет затем сделать перерасчет на количество крови в моче. Все это в совокупности существенно повышает точность способа, чем и достигается цель изобретения. Заявляемый способ может быть с успехом использован для оценки степени гематурии, являющейся важным клиническим симптомом преимущественно заболеваний органов мочеполовой системы. Он позволяет не только диагносцировать заболевание, но и проследить за динамикой патологического процесса, а также оценить эффективность лечения. Учитывая высокую чувствительность указанного способа, он может быть использован также для выявления и количественной оценки так называемой скрытой гематурии, которая нередко появляется на ранних стадиях инфекционных, септических, сердечно-сосудистых заболеваний и при некоторых физиологи- ческих состояниях организма (тяжелые физические нагрузки, переохлаждение и т.д.).

Использование: медицина для оценки степени гематурии в динамике физиологического и патологического процессов. Цель изобретения - повышение точности способа. Сущность изобретения: в определенном объеме мочи и гемолизата периферической крови измеряют концентрацию гемоглобина после окрашивания проб амидопиринанилинэтанольной смесью и регистрации их оптической плотности, а показатель вычисляют по формуле, приведенной в описании изобретения. 2 ил.

Способ определения количества крови в порции мочи, включающий обработку пробы мочи уксусной кислотой, перекисью водорода и красителем с последующей регистрацией интенсивности окраски, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, пробу дополнительно обрабатывают диэтиловым эфиром, при этом обработке подвергают фиксированный объем мочи и гемолизата периферической крови, в качестве красителя используют смесь 20%-ного раствора амидопирина, 5% -ного раствора сернокислого анилина и 96-градусного этилового спирта, взятых в соотношении 1 : 1 : 5 по объему, которую добавляют к эфирному экстракту мочи, интенсивность окраски регистрируют спектрофотометрически, а количество крови H в порции мочи рассчитывают по формуле
H= × 2,5,
где ε_м - экстинация пробы мочи;
ε_пp - экстинация пробы гемолизата крови;
ε_х - экстинация холостой пробы;
y - объем мочи, собранной за время T (мин), мл.