Способ обогащения биологического материала при бактериологическом исследовании на туберкулез Советский патент 1992 года по МПК A61B10/00 C12Q1/02 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано в диагностике туберкулеза.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ подготовки биологического материала для бактериологических исследований на туберкулез, включающий измельчение тканей, обработку серной кислотой и тщательное растирание пестиком в ступке.

Недостатком указанного способа является то, что при исследовании лимфатических узлов без туберкулезных поражений используется лишь часть измельченного материала, что значительно снижает его диагностическую ценность, так как внутри обрабатываемых кусочков и в неиспользованных частях тканей, доставленных для ис- следований. может содержаться возбудитель болезни, который не попадает в исследуемый материал.

Цель изобретения - повышение точности способа бактериологической диагностики туберкулеза.

Существенное отличие способа в том, что он позволяет максимально высвободить возбудителя из биологического материала, т.е. то его минимальное количество, которое обеспечивает рост микобактериальных колоний на питательных средах и развитие туберкулезного процесса у лабораторных животных,

Способ осуществляется следующим образом.

Отобранные, лимфатические узлы для исследований тщательно измельчают ножницами и переносят в коническую колбу (250-500 мл), в которую заливают на одну часть измельченной лимфатической ткани шесть частей искусственного желудочного сока с 4%-ной концентрацией медицинского пепсина и 1%-ной соляной кислоты (РН 1,6-2). нагретого до 35-37°С. Затем в колбу опускают магнитную палочку. Колбу закрывают капроновой пробкой, стявят на магнитную мешалку (ММ-5) и помещают в термостат. Ферментацию проводят при температуре 35-37°С в течение трех часов

Ё

VI СО

о

о

3

при непрерывной работе мешалки (1 тыс. об/мин).

По окончании ферментации содержимое колбы отстаивают в течение 30-40 с и надосадочную жидкость сливают в центрифужные флаконы, которые, в случае открытого центрифужного диска, закрывают пробками, помещают в предварительно дезинфицированную центрифугу и центрифугируют в течение 5 мин, при 4 тыс, об/мин. Надосадочную жидкость сливают. Осадок серо-белого или белого цвета, в зависимости от вида лимфатических узлов животных, объединяют, заливают 6-10%-ным раствором серной кислоты (1:7), тщательно перемешивают стерильной стекляной палочкой и центрифугируют 5 мин при 4 тыс, об/мин.

Надосадочную жидкость сливают, а осадок, представляющий собой сметанообраз- ную массу и составляющий обычно 8-9 частей от количества исходного материала (лимфатической ткани), дважды отмывают физиологическим раствором (1:7) тщательным перемешиванием стерильной стеклянной палочкой, соблюдая стерильность с последующим центрифугированием в течение 5 мин, при 4 тыс, об/мин. Затем, после повторного отмывания, надосадочную жидкость сливают с последующим прибавлением к осадку такого количества физиологического раствора, которое обеспечивает набор в шприц тщательно перемешанного осадка, т.е. используемый для дальнейших исследований материал должен представлять собой консистенцию, превышающую по густоте консистенцию молочных сливок, Посев на питательные среды проводят платиновой петлей.

П р и м е р 1. Для исследования влияния способа ферментации на высеваемость ми- кобактерий туберкулеза из биологического материала (лимфатических узлов) от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота из хозяйств с различной эпизоотической ситуацией в отношении туберкулеза и результаты биологической пробы, в сравнении с известным (способ А.П.Аликаевой), исследовали одновременно 40 проб.

Результаты исследований материала по предлагаемому способу и известному представлены в табл. 1.

В результате проведенных исследований установлено, что при обработке способом ферментации биоматериала с патологическими изменениями, отобранного на секции от трех животных неблагополучных стад, во всех случаях получены культуры микобактерий туберкулеза и одновременно, положительные результаты биологической пробы. При обработке способом А.П.Аликаевой соответствующие данные по культуральным и биологическим исследованиям установлены в двух из трех проб. При

исследовании материала без макроскопических поражений от 26 животных, реагирующих на туберкулин, неблагополучных хозяйств положительный результат при культуральных исследованиях получен в пя0 ти (19,2%) пробах и при биологических - в 16 (61,5%) пробах, обработанных способом ферментации, а по способу А.П.Аликаевой аналогичные результаты получены, соответственно, в трех (11,5%) и в пяти (19,2%)

5 пробах. При одновременном исследовании обоими способами частей лимфатических узлов, отобранных от реагирующих на туберкулин животных хозяйств, находящихся в режиме благополучия, получен отрица0 тельный результат.

В табл. 2 представлены сравнительные данные сроков появления роста культур микобактерий туберкулеза на питательных средах.

5 Из нее следует, что при исследовании биоматериала с туберкулезными поражениями двумя способами начало роста культур отмечается одновременно на 30-й день. При исследовании биоматериала без туберку0 лезных поражений также не отмечено достоверных различий в сроках появления роста культур микобактерий туберкулеза. Эти данные также подтверждают отсутствие влияния искусственного желудочного

5 сока на биологические свойства микобактерий туберкулеза.

Анализ данных исследований каждой пробы в отдельности, полученных по способу А.П.Аликаевой, не выявляет достоверных

0 различий между культуральными и биологическими результатами. Так. в семи пробах, в которых получен положительный результат на туберкулез по биологическим исследованиям, рост культур на питательных

5 средах отсутствует лишь в двух пробах. В то же время при исследовании по способу ферментации такой рост отсутствует в 11 пробах, что в 5,5 раз больше, чем по рутинному способу. Эти данные свидетельствуют о

0 том, что повышение результативности разработанного способа отмечается в основном за счет проведения биологических исследований.

В табл. 3 представлены обобщенные ре5 зультаты биологических исследований указанных выше проб.

Из нее следует, что если при заражении морских свинок материалом, приготовленным традиционным способом А.П.Аликаевой, в течение трех месяцев наблюдения

пало, начиная с 50 дня после заражения, семь (8,7%) опытных животных с признаками туберкулеза, то при заражении морских свинок материалом, приготовленным разработанным способом, пало, начиная с 30 дня, 15 (18,7%), что в два раза больше, чем в первом случае. Особенно показательны эти данные по результатам исследований биоматериала без изменений, полученные от крупного рогатого скота неблагополучных хозяйств. В этих пробах число заболевших животных, зараженных материалом по испытываемому способу, увеличивается до 2,2 раз, а из числа свинок подвергнутых ветеринарно-санитарной экспертизе, по завершении эксперимента - до 5,6 раз.

Во всех случаях наблюдается совпадение результатов бактериологических исследований, полученных по способу А.П.Аликаевой, с результатами, полученными при исследовании по способу ферментации.

П р и м е р 2. Для изучения возможного влияния желудочного сока на вирулентные свойства возбудителя проведено исследование шести культур микобактерий туберкулеза, полученный от трех проб материала, обработанных по способу А.П.Аликаевой и ферментации одновременно. Для этого проведено заражение морских свинок 0,1 мг суспензии микобактерий туберкулеза каждой из полученных культур по указанным способам. Результаты показывают, что все животные, зараженные культурами, выделенными способом ферментации и А.П.Аликаевой, погибают в течение трех месяцев. При этом, из числа животных, зараженных культурами, выделенными по способу А.П.Аликаевой, морские свинки погибают в течение 56,8 ± 5,7 дней, а по способу ферментации - 60,0 ± 9,4 дней (Р 0,05). Это свидетельствует об отсутствии какого-либо влияния искусственного желудочного сока на вирулентные свойства изучаемых культур микобактерий туберкулеза. На это указывают и результаты исследований, приведенные в таблице 3.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что лизис биоматериала, представленного для исследований, способствует высвобождению микобактерий из тканей лимфатических узлов, обогащению ими осадка при центрифугировании. В связи с тем, что для получения положительного результата биологической пробы на морских свинках достаточно пяти микобактерий туберкулеза, а для роста культур на питательных средах 20 - 100, объясняется повышение достоверности ферментативного способа и, следовательно, то, что по биопробе туберкулеза устанавливается в более частых случаях, чем при культураль- ных исследованиях этим же способом. Более достоверное различие в совпадении биопробы с культуральными исследованиями при использовании способа ферментации, в сравнении с контрольным способом, свидетельствует именно о высвобождении и

0 наличии того минимального количества возбудителя в 1 мл исследуемого материала, которое вызывает туберкулезный процесс у морских свинок, в то время как культураль- ные исследования дают отрицательные ре5 зультаты. Этого не наблюдается при исследовании традиционным способом, где высвобождается, вероятнее всего, такое число микобактерий, введенных морским свинкам, которое в большинстве случаев

0 обеспечивает и появление роста культур микобактерий туберкулеза на питательных средах.

В табл. 4 приведены обобщенные данные сравнительной эффективности культу5 ральных и биологических исследований каждой пробы двумя способами.

Из нее следует, что по разработанному способу положительные результаты бактериологических исследований на туберкулез

0 получены в 47,5%. а по традиционному, широко применяемому в ветеринарной практике способу- в 17,5% пробах биологического материала, что в 2,7 раза меньше, чем по предложенному.

5 Применение в разработанной методихе искусственного желудочного сока, магнитной мешалки существенно облегчает технический труд специалистов, позволяет в дотоверно большем объеме использовать

0 материал, поступающий для исследований. Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет повысить эффективность результатов бактериологических исследований биологического

5 материала (лимфатических узлов) в 2,7 раза, что, в свою очередь, дает возможность повысить точность диагностики туберкулеза. Это достоверно повысит эффективность диагностики болезни и во многих случаях

0 предупредит широкое распространение туберкулеза животных.

Формула изобретения Способ обогащения биологического материала при бактериологическом исследо5 вании на туберкулез, включающий взятие лимфотической ткани с последующим измельчением, обработкой раствором серной кислоты и гомогенизацией, отличающийся тем, что, с целью повышения частоты высеваемости микобактерий, измельченный биологический материал дополнительно обрабатывают искусственным желудочным соком, содержащим 4%-ный

медицинский пепсин и 1 %-ный раствор соляной кислоты, причем обработку проводят 3 ч при постоянном перемешивании.

Использование: ветеринарная микробиология, диагностика туберкулеза, бактериология обогащения биологического материала. Сущность изобретения: в способе обогащения биологического материала при бактериологическом исследовании на туберкулез предварительно измельченный материал обрабатывают искусственным желудочным соком, содержащим 4% медицинского пепсина Vi 1%-ный раствор соляной кислоты. Обработку проводят в течение 3 ч при постояннЬм перемешивании 4 табл.

Примечание: Ф- исследовано по способу ферментации; А- исследовано по способу Аликаевой (прототип).

Примечание. Ф- исследовано по способу ферментации; А- исследовано по способу Аликаевой. „

Таблица 1

Таблица 2

Сравнительные результаты сроков гибели и ветеринарно-санитарной Экспертизы павцих и убитых морских свинок

Примечание: Ф- исследовано по способу ферментации; А- исследовано по способу Аликаевой.

ТабпицзЗ

Таблица 4