СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2007 года по МПК A61B10/00 C12R1/32 

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для выявления некультивируемых форм микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота.

Известен способ диагностики туберкулеза животных, включающий бактериологическое и биологическое исследования с целью обнаружения возбудителя заболевания. Для этого в случае отсутствия у реагирующих на туберкулин животных видимых изменений или возникших затруднений в определении характера патологических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах проводят отбор биоматериала, готовят мазки-отпечатки для световой микроскопии и суспензию для посевов на питательные среды и заражения лабораторных животных. Затем с целью получения культуры микобактерий проводят посев суспензии на питательные среды. Параллельно с культуральными исследованиями проводят выявление микобактерий туберкулеза в биоматериале путем введения посевной суспензии трем морским свинкам. За животными ведут наблюдение в течение 3-х месяцев. Погибших в течение срока наблюдения морских свинок вскрывают и проводят патолого-анатомическое исследование. При отсутствии падежа свинок убивают через три месяца и проводят патолого-анатомическое и бактериоскопическое исследования. Получение культуры микобактерий туберкулеза на питательных средах и положительный результат патолого-анатомического исследования или бактериоскопии биоматериала от морских свинок дают основание для постановки диагноза (Наставление по диагностике туберкулеза животных: Утв. Департаментом ветеринарии М-ва сел. хоз-ва России 18.11.02. - 2002. - С.27-37).

Недостатком способа является то, что в отдельных случаях из биоматериала от убитых с диагностической целью животных, реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих, без характерных для туберкулеза патолого-анатомических изменений, ни культуральными исследованиями, ни биопробой не удается выделить микобактерий туберкулеза, хотя их наличие возможно, исходя из положительной реакции на ППД-туберкулин. Вследствие этого не выявляются животные с латентным течением инфекции. Эта форма заболевания представляет серьезную опасность в эпизоотологическом отношении, так как животные-носители скрытой туберкулезной инфекции - могут стать причиной повторных вспышек заболевания в оздоровленных хозяйствах.

Задачей заявляемого изобретения является выявление некультивируемых форм микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота и сокращение сроков диагностики.

Технический результат - выявление некультивируемых форм микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота и сокращение сроков диагностики туберкулеза у реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота - скрытого носителя туберкулезной инфекции - при отсутствии характерных для туберкулеза патолого-анатомических изменений.

Указанный технический эффект достигается тем, что перед посевом на питательную среду отобранным для анализа биоматериалом от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота, при вскрытии которого не обнаруживают характерных для туберкулеза изменений, заражают морских свинок и осуществляют пассирование зараженного биоматериала через организм морских свинок с интервалом в 21 день. Морским свинкам при проведении пассажей вводят внутримышечно кортизон в дозе 12,5 мг на голову. Способ позволяет восстановить способность микобактерий туберкулеза к росту на питательной среде, сокращает сроки и повышает точность диагностики.

Пример.

Отобрали биоматериал без характерных для туберкулеза патолого-анатомических изменений от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота из оздоровленного от этого заболевания хозяйства.

Исследуемый первичный биоматериал согласно Наставлению по диагностике туберкулеза животных (2002) подвергли обработке по методу Гона-Левенштейна-Сумиоши 2%-ным раствором серной кислоты и посеяли на 5 пробирок питательной среды ФАСТ-3Л. Посевы инкубировали 30 суток. Результаты световой микроскопии мазков-отпечатков из первичного биоматериала и мазков из посевной суспензии, окрашенных по Цилю-Нильсену, были отрицательными. Одновременно с бактериологическим исследованием провели биопробу на морских свинках, предварительно проверенных на спонтанное заражение микобактериями. Для этого сформировали 3 группы морских свинок - контрольную и 2 опытных. В контрольной и 1-й опытной группах по 3 морских свинки, во 2-й опытной - по 3 головы для каждого пассажа. Посевную суспензию нейтрализовали 10%-ным стерильным раствором двууглекислой соды, отстаивали до оседания крупных частиц. Надосадочную жидкость набирали в стерильный шприц и инъецировали морским свинкам обеих опытных групп подкожно в область паха в дозе 1 мл на голову.

За животными 1-й опытной группы вели наблюдение в течение трех месяцев в соответствии с Наставлением по диагностике туберкулеза животных (2002). По истечении этого срока все морские свинки остались живы, клинических признаков заболевания туберкулезом отмечено не было. При патолого-анатомическом исследовании отметили незначительное увеличение регионарных лимфатических узлов. Результаты световой микроскопии мазков-отпечатков из внутренних органов и лимфатических узлов и культурального исследования в течение 30 суток были отрицательными. Таким образом, в 1-й опытной группе из первичного материала микобактерии выделены не были.

Во 2-й опытной группе перед посевом на питательную среду отобранной пробой заражали морских свинок и осуществляли пассирование зараженного биоматериала через организм морских свинок.

В каждом пассаже с целью повышения чувствительности морских свинок к микобактериям туберкулеза одновременно с введением подкожно в область паха в дозе 1 мл на голову суспензии первичного биоматериала дополнительно внутримышечно вводили кортизон в дозе 12,5 мг на голову.

В I-м пассаже через 21 день проверили чувствительность животных к ППД-туберкулину для млекопитающих. Через 24 часа у всех животных в месте введения туберкулина обнаружили незначительное покраснение и припухлость диаметром 1-1,5 мм. Через 48 часов у двух морских свинок реакция на туберкулин сохранилась, у третьей - исчезла. Всех животных подвергли эвтаназии. На вскрытии обнаружили незначительную гиперплазию регионарных лимфатических узлов, в которых при микроскопии мазков-отпечатков были обнаружены единичные очень мелкие некислотоустойчивые кокки. Культивирование посевов на питательной среде дало отрицательный результат.

Для восстановления способности к росту на питательной среде обнаруженных при бактериоскопии некислотоустойчивых микроорганизмов при I-м пассаже провели II-й пассаж. Для этого суспензией биоматериала от животных I-го пассажа в дозе 1 мл на голову заразили следующую группу морских свинок. Через 21 день проверили чувствительность животных к ППД-туберкулину. Через 24 часа у всех животных в месте введения аллергена отмечали покраснение, уплотненную припухлость в диаметре 3-4,5 мм. Через 48 часов реакция сохранилась у всех животных. При патолого-анатомическом исследовании обнаружили гиперплазию всех лимфоузлов. Микроскопией мазков-отпечатков из лимфатических узлов обнаружили небольшое количество некислотоустойчивых и единичных кислотоустойчивых кокков. При культуральном исследовании снова получен отрицательный результат.

С целью возможного получения типичных форм микобактерий посевную суспензию биоматериала от животных II-го пассажа ввели морским свинкам в дозе 1 мл на голову (III пассаж). Через 21 день проверили чувствительность животных к ППД-туберкулину. Через 24 часа у всех животных реакция на туберкулин характеризовалась гиперемией, уплотненной припухлостью диаметром 4,7-4,8 мм. Через 48 часов реакция сохранилась у всех морских свинок. При клиническом осмотре животных отмечали увеличение и уплотнение паховых лимфоузлов. На вскрытии обнаружили увеличение всех лимфатических узлов и единичные очень мелкие белые очажки в печени. При микроскопии мазков-отпечатков из печени и лимфатических узлов обнаружили мелкие нежные единичные слегка изогнутые зернистые кислотоустойчивые палочки, кислото- и некислотоустойчивые кокки. На среде ФАСТ-3Л через 16 суток был получен скудный рост мелких сухих колоний цвета слоновой кости, при микроскопии которых обнаружены кислотоустойчивые слегка изогнутые нежные палочки, некоторые - зернистые.

Незараженных морских свинок, являющихся контролем, каждые 21 день исследовали с помощью ППД-туберкулина и по окончанию опыта подвергли эвтаназии. На протяжении всего опыта все морские свинки контрольной группы были клинически здоровы. Реакций на туберкулин у них не отмечали. На вскрытии каких-либо изменений в органах не обнаружили. Результаты культурального исследования на среде ФАСТ-3Л в течение 30 дней были отрицательными. Спонтанное заражение морских свинок 2-й опытной группы в условиях вивария исключили.

Таким образом, предложенный способ позволяет выявить некультивируемые формы микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота, которые явились причиной реагирования крупного рогатого скота из оздоровленного хозяйства на ППД-туберкулин. Предлагаемый способ позволяет сократить сроки диагностики.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления некультивируемых микобактерий туберкулеза. Способ предусматривает отбор биоматериала от реагирующих на ППД-туберкулин животных без характерных для туберкулеза патолого-анатомических изменений, заражение морских свинок этим биоматериалом, пассирование зараженного биоматериала через организм морских свинок с интервалом в 21 день, посев на питательные среды и выявление микобактерий туберкулеза. Изобретение позволяет повысить точность диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и сократить ее сроки. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ выявления некультивируемых микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота, включающий отбор пробы для анализа, посев на питательную среду и выявление микобактерий туберкулеза, отличающийся тем, что перед посевом на питательную среду отобранной пробой заражают морских свинок и осуществляют пассирование зараженного биоматериала через организм морских свинок с интервалом в 21 день.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что морским свинкам при проведении пассажей вводят внутримышечно кортизон в дозе 12,5 мг на голову.