СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2015 года по МПК G01N33/49 G01N21/76 

Изобретение относится к биологии, а именно к разделу иммунологии. Оно может быть использовано для хемилюминесцентного (ХЛ) анализа в науке, ветеринарии, медицине, экологии.

Известна работа В.Ю. Куликова, Г.В. Данилевич, Э.Б. Фридмана, Л.А. Куликовой «Вопросы биофизики» (1967), которые изучали особенности индуцированной ХЛ сыворотки крови у больных с воспалительными и невоспалительными заболеваниями в кинетике внутренних болезней. В качестве индуктора ХЛ использовали 15%-ный раствор NaOH, который в объеме 0,1 мл добавляли к 1,0 мл исследуемой сыворотки. ХЛ регистрировали при Т +22°C квантометрической установкой, работающей в режиме счетчика квантов. В качестве детектора светового излучения использовали фотоэлектронный уловитель ФЭУ-39. Обследовано 147 больных, из них 40 - больных туберкулезом: а) больные с выраженной активностью воспалительного процесса - 21 чел.; б) больные с минимальной активностью - 19 чел. Наибольшей хемилюминесценцией обладали сыворотки крови больных с активными воспалительными процессами.

Также в литературе имеется работа Ф.К. Шарипова, Г.В. Киреева «Свободнорадикальное окисление сыворотки крови больных с опухолями головного мозга» (Республиканский онкологический научный центр МЗ РУз, Республика Узбекистан, г. Ташкент, 2003), в которой изучены закономерности свободнорадикального окисления сыворотки крови больных с опухолями головного мозга методом хемилюминесценции. После инкубации разведенной сыворотки крови с солями двухвалентного железа наблюдали типичную для липосодержащих систем картину развития свечения - быструю вспышку, угнетение свечения, медленную вспышку, переходящую в стационарное свечение. На каждой из этих стадий наблюдали положительную корреляцию между интенсивностью свечения и скоростью накопления продуктов перекисного окисления липидов - малонового диальдегада и концентрацией двухвалентного железа.

Недостатками этих способов является применение их только в медицине, а в качестве индуктора - использование 15%-ного раствора NaOH и двухвалентного железа, обладающих неспецифическим стимулирующим действием.

Наиболее близким техническим решением является «Способ прижизненной диагностики туберкулеза» (см. патент РФ №2389020 от 10 мая 2010 г., G01N 33/569). Способ прижизненной диагностики туберкулеза включает выделение полиморфноядерных лейкоцитов, сохранение их в стабилизирующем растворе, определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции с использованием в качестве индуктора «дыхательного взрыва» опсонизированного зимозана, а в качестве дополнительного индуктора - инактивированный вакцинный штамм БЦЖ.

Недостатком этого способа является трудоемкий процесс приготовления и короткий срок использования исследуемого материала - выделенные полиморфноядерные лейкоциты (где в цитоплазматической мембране клетки определяется уровень свободнорадикального окисления) остаются жизнеспособными и пригодными для исследований не более 3-4 часов. Диагностику можно проводить только при острой фазе туберкулеза. Также не обеспечивается дифференциальная диагностика туберкулеза, учет ХЛ проводится только по одному показателю интенсивности свободнорадикального окисления.

Техническим результатом способа является снижение трудоемкости и безопасности, увеличение срока пригодности объекта исследований, ведущее к повышению точности прижизненной дифференциальной диагностики неспецифических реакций на ППД-туберкулин у крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах, ускорению процесса дифференциальной диагностики и, как следствие, предотвращению необоснованного убоя продуктивных животных в хозяйствах различных форм собственности, в том числе фермерских.

Заявленный технический результат способа прижизненной диагностики туберкулеза включает определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции, в качестве объекта исследований используется сыворотка от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств, а инактивированную вакцину БЦЖ используют в качестве основного индуктора.

Способ осуществляют следующим образом: проводят забор крови от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств; получают сыворотку стандартным способом путем отстаивания крови в термостате, обводки образовавшегося сгустка и дальнейшего центрифугирования образовавшейся сыворотки. В качестве основного индуктора используют инактивированную вакцину БЦЖ.

Добавляют: 20 мкл раствора люминола, 400 мкл сыворотки, 50 мкл инактивированной вакцины БЦЖ, 50 мкл стабилизирующего раствора для отрицательного контроля антигена.

Приготовление люминола - люминол-гидразид-3-фталевой кислоты, 40 мг люминола растворяют горячим (~100°C) раствором 0,01 н. NaOH. Определяют pH 7,2, доводят общий объем до 20 мл 1-кратным раствором Хэнкса без фенолового красного.

Приготовление основного индуктора - инактивированный вакцинный штамм БЦЖ.

Исходя из того, что вакцинный штамм БЦЖ имеет филогенетическое родство с патогенными микобактериями туберкулеза, в качестве антигена использовали вакцину БЦЖ (Медгамал вакцина Имурон) - производства Государственное учреждение НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, утвержденную Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 26.12.2003 г.

Для получения стандартного разведения сухую вакцину (в 1 ампуле содержится 25 мг лиофилизированной живой бактериальной массы штамма БЦЖ) растворяли в 5,0 мл изотонического раствора NaCl, т.е. в 0,2 мл раствора содержится 1 мг сухого вещества.

Для использования in vitro в ХЛ реакции вакцинный штамм БЦЖ в стандартном разведении инактивировали автоклавированием при режимах: 1 атм 130-150°C - 2 ч и 2 атм 130-150°C - 1 ч. Контрольный посев инактивированного вакцинного штамма БЦЖ на питательные среды Левенштейна-Йенсена и ФАСТ-3Л показал отсутствие роста культуры при вышеуказанных режимах инактивации.

В РСК провели проверку специфической активности различных разведений вакцинного штамма БЦЖ. В качестве эталона (контроля) использовали показатели аналогичной титрации в РСК антигена ВНИИБТЖ.

Таблица 1. Титрация туберкулезного антигена (вакцинный штамм БЦЖ) Стандартное разведение БЦЖ 1:10 1:20 1:40 1:60 1:80 1:100 1:120 ++ + - - -   - -

Из таблицы 1 видно, что оптимальным разведением является стандартное разведение вакцинного штамма БЦЖ, применяемое для вакцинации in vivo и способное индуцировать ХЛ реакцию in vitro.

Оценку спонтанной и индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции проводили в течение 180 мин на 36-канальном хемилюминесцентном анализаторе CL3604 (Россия). Регистрацию результатов и управление хемилюминесцентным анализатором осуществляли посредством микроЭВМ IBM/PC/AT.

В исследуемых объектах определяли следующие показатели: максимальное значение концентрации свободных радикалов (интенсивность сигнала) - Imax; интегральный показатель генерации активных форм кислорода (площадь кривой - светосумма) - S; антиоксидантный показатель, коррелирующий со скоростью падения хемилюминесценции и обратно пропорциональный скорости свободнорадикального окисления - tg L.

Результаты исследований регистрировали, записывали и обрабатывали на ЭВМ (ПК), по максимуму свечения, в абсолютных значениях - импульсах в секунду. Оценку проводили в относительных значениях превышения уровня ХЛ опытных и контрольных проб, т.е. метаболический статус кислородзависимых процессов полиненасыщенных липопротеидов лимфокинов в сыворотке крови оценивали по динамике индуцированной ХЛ, сопоставляли скорость подвижного равновесия свободнорадикального окисления (Imax) и антиоксидантной системы (tg L) у здоровых и зараженных животных.

Проведена математическая обработка с определением средней арифметической, ошибки средней арифметической, коэффициента достоверности.

Учет результатов реакции.

Здоровое животное - с повышенной чувствительностью к туберкулину (сенсибилизированное)

Коэффициент достоверности значений Imax Р>0,1 («недостоверно» - нет увеличения уровня свечения исследуемой пробы от здорового животного по сравнению с контролем при взаимодействии с туберкулезным антигеном)

Антиоксидантный потенциал (tg L) исследуемой пробы здорового животного по абсолютному показателю выше контрольной пробы.

Инфицированное животное

Положительной на туберкулез считается проба, где коэффициент достоверности значений Imax Р<0,01; («достоверно» - есть увеличение уровня свечения опытной пробы по сравнению с контрольной при взаимодействии с туберкулезным антигеном).

Антиоксидантный показатель (tg L) исследуемой пробы ниже контрольной.

Опыт 1. В опыте на морских свинках, зараженных Mycobacterium bovis штамм 14, определены критерии оценки результата ХЛ сыворотки - максимальное значение концентрации свободных радикалов (интенсивность сигнала) - Imax, интегральный показатель генерации активных форм кислорода (площадь кривой - светосумма) - S; антиоксидантный показатель, коррелирующий со скоростью падения хемилюминесценции и обратно пропорциональный скорости свободнорадикального окисления - tg L.

Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Результаты ХЛ исследований сыворотки крови морских свинок, экспериментально зараженных М. bovis штамм 14   Интенсивность сигнала (I), абсолют. значения (имп./с) Светосумма (S), относит. значения Антиоксидантный показатель (tg L), относит. значения Контроль - сыворотка от здоровых морских свинок М±m 1190,6±24,8 1,52±0,18 0,22±0,024 P       Опыт, дни после заражения 3-й день       М±m 1169,4±10,3 1,14±0,002 0,195±0,03 P 0,454     7-й день       М±m 1190,2±33,81 1,87±0,003 0,141±0,017 P 0,993     14-й день       М±m 1325,9±52,7 2,09±0,018 0,164±0,014 P 0,037     21-й день       М±m 1423,2±87,02 1,40±0,006 0,204±0,026 P 0,023    

При анализе таблицы 2 видно, что в эксперименте в динамике развития туберкулезного процесса у лабораторных животных изменяются и абсолютные, и относительные значения. В частности, на 3-й и 7-й дни нет изменений в абсолютных значениях, но есть изменения в относительных показателях - изменяется антиоксидантный потенциал (tg L) в сторону уменьшения по сравнению с контролем. На 14-й и 21-й дни достоверные различия в абсолютных показателях - превышение уровня свечения ХЛ у опытных групп по сравнению с контролем.

На 28-й день опыта получены недостоверные результаты и абсолютных, и относительных значений. Такие результаты ХЛ реакции последнего срока исследования мы предположительно связываем с тем, что с наступлением генерализованной формы туберкулезного процесса, что подтверждается патологоанатомической экспертизой, выявляется феномен хемилюминесцентной анергии, который проявляется отсутствием адекватного ответа в ХЛ реакции на контакт со специфическим индуктором - антигеном (нарушение антигенспецифического ответа).

Патологоанатомическая экспертиза опытных животных дала следующие результаты.

На 3-й и 7-й дни после заражения при патологоанатомической экспертизе внутренних органов изменений нет;

на 14-й день: в месте введения - сосудистая реакция, ограниченный абсцесс, селезенка не увеличена;

на 21-й день - в месте введения туберкулезный абсцесс, в печени всех опытных животных творожистые узелки, селезенка увеличена в 1,5-2 раза;

к 28-му дню при патологоанатомической экспертизе внутренних органов отмечена выраженная форма генерализованного туберкулеза - увеличение селезенки в 3-4 раза, множественные узелки желтоватого цвета в селезенке и печени, в месте введения - язвы.

Полученные результаты ХЛ измерений биоматериала здоровых и больных туберкулезом животных также оценивались по общепринятым статистическим критериям достоверности - при бактериологическом исследовании при посеве патологического материала внутренних органов опытных свинок на стандартные питательные среды выделена исходная заражающая культура M.bovis штамм 14.

Опыт 2. Проведен научно-производственный опыт на взрослом поголовье крупного рогатого скота, показавшего при плановых аллергических исследованиях на туберкулез положительный результат при внутрикожном введении стандартного ППД-туберкулина для млекопитающих. Коровы и нетели из неблагополучного по туберкулезу хозяйства Омской области.

Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 ХЛ сыворотки крови крупного рогатого скота из неблагополучного по туберкулезу хозяйства (СПК «Украинский» Исилькульского района Омской области). Хоз-во Исслед. проб Интенсивность сигнала (I), абсолют. значения (имп./с) Светосумма (S), относит. значения Антиоксидантный потенциал (tg L), относит. значения контроль опыт контроль опыт контроль опыт   60             М±m   1151±12,9 1187,75±43,72 6,31±1,64 6,25±1,61 0,287±0,055 0,278±0,059 Р     0,069   0,941   0,010

Из таблицы 3 следует, что в абсолютных значениях исследуемых проб в данном хозяйстве значения коэффициента достоверности P «достоверно» - есть превышение уровня ХЛ свечения исследуемых проб по сравнению с контролем; антиоксидантный показатель (tg L) в исследуемых пробах ниже контрольных значений. Результат ХЛ исследования - положительный, диагноз на туберкулез - положительный.

При посеве на стандартные питательные среды Левенштейна-Йенсена и ФАСТ-3Л биоматериала от положительно реагировавших коров выделены полевые штаммы микобактерий бычьего вида. Биопробы на морских свинках - положительные.

Таким образом, ХЛ исследования сыворотки крови от положительно реагирующих на ППД-туберкулин животных из неблагополучного по туберкулезу хозяйства можно использовать в комплексе ветеринарно-диагностических мероприятий при постановке первичного диагноза.

Опыт 3. Проведен научно-производственный опыт на взрослом поголовье крупного рогатого скота, показавшего при плановых аллергических исследованиях на туберкулез положительный результат при внутрикожном введении стандартного ППД-туберкулина для млекопитающих. Коровы и нетели из длительно благополучных по туберкулезу (более 10 лет) хозяйств Омской и Новосибирской областей.

Полученные результаты представлены в таблице 4. Из таблицы 4 следует, что в абсолютных значениях исследуемых проб во всех перечисленных хозяйствах значения коэффициента достоверности Р «недостоверно» - нет превышения уровня ХЛ свечения исследуемых проб по сравнению с контролем; антиоксидантный показатель (tg L) в исследуемых пробах выше значений контрольных. Результат - отрицательный, туберкулез крупного рогатого скота исключен, реакции на ППД-туберкулин ложноположительные.

При бактериологическом исследовании биоматериала от положительно реагировавших коров выделены атипичные микобактерии 3-4 группы по классификации Раньона, которые являются одними из основных факторов сенсибилизации. Биопробы на морских свинках - отрицательные.

Таблица 4 Результаты ХЛ исследований сыворотки крови крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств Хоз-во Иссл. проб Интенсивность сигнала (I), абсолют. значения (имп./с) Светосумма (S), относит. значения Антиоксидантный показатель (tg L), относит. значения контроль опыт контроль опыт контроль опыт ЗАО Дружба Марьяновского района Омской обл. 79             М±m   1172,64±45,41 1164,21±33,44 1,35±0,002 1,33±0,002 0,227±0,042 0,327±0,046 P     0,882         ЗАО «Азовское» Азовского района Омской обл. 26             М±m   1392,75±206,8 1405±211,4 7,19±0,4 7,22±0,4 0,288±0,124 0,341±0,1 24 P     0,768         ОАО «Неудачино» Татарского района Новосибирской обл. 53             М±m   1132 1133 9,22±0,4 9,26±0,4 0,130± 0,132± Р     0,816         ЗАО «Знамя» Марьяновского района 12            

Омской обл.               M±m   1129,11±8,21 1143,55±22,38     0,178±0,008 0,182±0,005 P     0,185         СПК «Титан» Исилькульского района Омской обл. 21             М±m   1255,6±6,12 1253±6,63 1,22±0,003 1,22±0,002 0,416±0,004 0,419±0,004 P     0,806         ОАО ПКЗ «Омский» Марьяновского района Омской обл. 12             М±m   1374,33±10,27 1374,9±11,306 1,54±0,001 1,54±0,002 0,406±0,007 0,418±0,005 P     0,970         ИТОГО 193            

Таким образом, прижизненный ХЛ метод исследования сыворотки крови от положительно реагирующих на ППД-туберкулин животных из благополучных по туберкулезу хозяйств можно использовать в комплексе дифференциальной диагностики неспецифических реакций.

Пример 1. В соответствии с календарным планом работ исследовано на туберкулез 836 коров и нетелей, принадлежащих ОАО «Неудачино» Татарского района Новосибирской области. Положительную реакцию на ППД-туберкулин дали 53 головы, из них 6 голов - повторно реагирующие. С целью уточнения диагноза проведен контрольно-диагностический убой 8 голов крупного рогатого скота. При патологоанатомической экспертизе внутренних органов и лимфатических узлов убитых животных изменений, характерных для туберкулеза, не обнаружено.

Проведено лабораторное исследование биоматериала от 8 голов крупного рогатого скота - посев на стандартные питательные среды Левенштейна-Йенсена, ФАСТ-3Л, полужидкую среду ПС-1 для выявления L-форм. Проведены биопробы на лабораторных животных.

При бактериологическом исследовании во всех случаях возбудителей бычьего, человеческого и птичьего видов не выделено. Из биоматериала от 3-х голов выделены атипичные микобактерии 4-й группы по классификации Раньона.

При исследовании методом ПЦР смывов культур с питательных сред с использованием видоспецифичных праймеров (тест-система «МТБ-КОМ» производства НИИ эпидемиологии, г. Москва) результат - отрицательный.

Результаты биологической пробы на морских свинках отрицательные.

Для повышения точности дифференциальной диагностики неспецифических реакций исследовано хемилюминесцентным методом 58 проб сывороток крови. Результаты ХЛ исследований - отрицательные.

На основании проведенных комплексных исследований в 2008 г. подтверждено благополучие ЗАО «Неудачино» Татарского района по туберкулезу крупного рогатого скота.

Таким образом, предотвращен убой 39 голов крупного рогатого скота, что способствовало сохранению поголовья животноводческой фермы и повышению объема производства мясо-молочной продукции.

Получение продукции от сохраненных коров:

Удой от 1 коровы в 2008 г. - 5304 кг.

Реализационная цена 1 кг молока - 9, 37 руб.

Получено от 1 коровы молока в год на 49698,48 руб. (9,37×5304=49698,48 руб.).

Получено от 39 коров молока в год на 1938240,72 руб. (49698,48×39=1938240,72 руб.).

Получено телят от 39 коров - 30 гол. (39 гол.×0,78=30 гол.)

Стоимость 30 рожденных телят 3480 руб.×30=104400 руб

Всего произведено продукции оставленными в стаде коровами (39 гол.) на сумму 2042640,72 руб. (1938240,72 руб.+104400 руб.)

Анализ показал, что в отличие от известного способа, использование предлагаемого способа прижизненной диагностики туберкулеза позволяет дифференцировать неспецифические реакции на ППД-туберкулин у крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах, снижает трудоемкость и более технологичен, увеличивает срок пригодности объекта исследований, снижает материальные затраты в 10 и более раз. При использовании предлагаемого способа в общем комплексе противотуберкулезных мероприятий создаются условия для предотвращения необоснованного убоя животных, сохранения поголовья животноводческих ферм и повышения объема производства мясо-молочной продукции.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к иммунологической диагностике заболеваний крупного рогатого скота (КРС) в общем комплексе противотуберкулезных мероприятий. Для этого проводят прижизненную диагностику туберкулеза, которая включает определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции в сыворотке от положительно реагирующего на ППД-туберкулин КРС. В качестве основного индуктора используют инактивированную вакцину БЦЖ. Проведение диагностики позволяет исключить неспецифические реакции на ППД-туберкулин КРС в благополучных по туберкулезу хозяйствах. Изобретение позволяет повысить точность дифференциальной диагностики неспецифических реакций на ППД-туберкулин у КРС и сохранить поголовье животноводческих ферм. 4 табл., 1 пр.

Способ прижизненной диагностики туберкулеза, включающий определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции, отличающийся тем, что в качестве объекта исследований используется сыворотка от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств, а инактивированную вакцину БЦЖ используют в качестве основного индуктора.