СПОСОБ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ НОКАРДИОФОРМНЫХ АКТИНОМИЦЕТОВ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, касается способа бактериологического выявления нокардиоформных актиномицетов и может быть использовано при диагностике туберкулеза.

Филогенетическая группа, обозначенная как «нокардиоформные актиномицеты», включает роды Corynebacterium, Mycobacterium, Caseobacter, Nocardia, Rhodococcus. Все эти микроорганизмы имеют общие антигены, обусловливающие сенсибилизацию макроорганизма и повышение чувствительности к туберкулину, что является причиной ложно положительных туберкулиновых реакций. Так, по некоторым данным, положительные туберкулиновые реакции могут регистрироваться в более чем 80% хозяйств, причем в 13,3% хозяйств от крупного рогатого скота выделяли возбудителей туберкулеза, в 54,3% хозяйств - атипичные микобактерии и в 32,3% хозяйств природа аллергии к туберкулину не установлена [1]. Положительные туберкулиновые реакции у сенсибилизированных к актиномицетам животных и в большинстве случаев наличие туберкулезоподобных изменений при патологоанатомических исследованиях приводят к неоправданному убою животных. Аллергический метод диагностики туберкулеза подтверждается бактериологическими исследованиями, преимущественно выделением культуры возбудителя из патологического материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой, обильный рост которой на полноценных, богатых белком, углеводом, минеральными веществами и стимуляторами роста питательных средах сдерживает рост микобактерий и затрудняет их выделение.

Известны способы бактериологического выявления микобактерий, включающие предпосевную обработку патологического материала для подавления сопутствующей микрофлоры и высвобождения кислотоустойчивых микроорганизмов из органических субстратов с применением химических веществ, бактерицидно действующих на неспецифическую микрофлору и щадящих микобактерий туберкулеза, в различных концентрациях при разной экспозиции, в частности, 3-20%-ных растворов серной кислоты, 3-15%-ных растворов соляной кислоты, 2-4%-ных растворов едкого натра,3-15%-ных растворов щавелевой кислоты, 10%-ного раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия, 0,14%-ного раствора хлоргексидинглюконикума [2]. Общим недостатком известных способов является недостаточная эффективность при сложности осуществления из-за необходимости четкой временной экспозиции и тщательной отмывки посевного субстрата. Используемые в медицинской практике для обработки мокроты такие детергенты, как двузамещенный фосфорнокислый натрий, трехзамещенный фосфорнокислый натрий и хлоргексидинглюконикум, при воздействии на патологический материал (лимфатические узлы) в течение 30 минут, 1, 2 часов и 1 суток не обеспечивали подавление сопутствующей микрофлоры, а в 96% случаев посевы были загрязнены банальной микрофлорой. При обработке 3%-ными растворами кислот и 20%-ным раствором едкого натра процент загрязнения составлял от 50 до 80. После обработки 5%-ным раствором щавелевой кислоты без последующего промывания физиологическим раствором посев можно проводить только на среду Гельберга. Кроме того, в 25% случаев при использовании среды Гельберга и в 100% случаев при использовании среды Левенштейна-Йенсена установлено снижение рН, о чем свидетельствовало изменение цвета среды. Процент загрязнения 33. При обработке патологического материала по методу А.П.Аликаевой растворами кислот более высокой концентрации (10-15%) после однократного промывания (в течение 5 минут физиологическим раствором) в 70% случаев отмечено снижение рН среды, и посевы уничтожались. При использовании же щелочей из-за сильного разбухания волокон тканей затруднялись отбор материала и распределение его по среде при посеве [3]. При использовании 10%-ного раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия посевной осадок патологического материала содержит мелкую или крупную дисперсную взвесь кристаллов препарата вследствие его высокой концентрации, что делает посевной осадок мутным, крошковатым и затрудняет визуальную оценку посевов на плотных питательных средах.

Предпосевная обработка патологического материала с применением известных детергентов уничтожает не только сопутствующую микрофлору, но и слабокислотоустойчивые микобактерии, коринебактерии, родококки и нокардии, что снижает эффективность их выделения.

В качестве предпочтительного аналога нами рассматривается способ выявления микобактерии туберкулеза, включающий предпосевную обработку патологического материала водным раствором препарата «Лесептик» в концентрации 0,1% смешиванием в равных объемах, выдержку в течение 18-24 часов при комнатной температуре, посев на плотную питательную среду и бактериоскопию посевного остатка [4]. Известный способ позволяет выявлять микобактерии, утратившие способность расти на искусственных питательных средах.

Цель изобретения - эффективный и простой в осуществлении способ бактериологического выявления нокардиоформных актиномицетов в патологическом материале от животных с положительной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих.

Поставленная цель достигается предпосевной обработкой парных образцов пробы патологического материала препаратом «Лесептик» различной концентрацией при разной экспозиции.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Для предпосевной обработки патологического материала готовили 0,5%- и 2,0%-ные водные растворы препарата «Лесептик» смешиванием 5 и 20 мл концентрата с дистиллированной водой до 1000 мл. Из пробы патологического материала (брыжеечные, заглоточные, подчелюстные лимфатические узлы, участки тощей и подвздошной кишок, печень, легкие) готовили парные образцы, которые разрезали на кусочки размером 0,5×0,5 см, заливали первый образец 0,5%-ным, второй образец - 2,0%-ным водным раствором препарата «Лесептик» в объемном соотношении 1:2 с экспозицией 3 часа и 15 минут соответственно при комнатной температуре, после чего раствор препарата «Лесептик» сливали, образцы отмывали дважды изотоническим раствором хлорида натрия, тщательно растирали в ступке, полученную суспензию засевали на плотные яичные среды и выращивали в термостате при температуре +37°С.

Пример 2. Для обоснования заявленных параметров способа изучали бактерицидное действие различных концентраций препарата «Лесептик» при разных экспозициях на микроорганизмы 1, 2 и 3 групп устойчивости in vitro. Использовали культуры микроорганизмов, полученные из ГИСК им. Л.А.Тарасовича - Всероссийской коллекции микроорганизмов, и следующие среды: Эндо, Сабуро, Чапека-Докса, висмут-сульфитный агар, солевой агар, Левенштейна-Йенсена. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1.Бактерицидное действие препарата «Лесептик» в зависимости от концентрации и экспозицииКультураКонцентрация препарата «Лесептик» (%), экспозиция (часов)0,30,51,02,01231230,40,21,00,40,21,0Prot. mirabilis, №237++++--------Shig. flexneri, №170+++---------Е.coli, №17+++++-------Staph. aureus, №209++++--------Enterobac. faecalis, №4+++++-------Salm. tm., №18+++++-------M.avium++++++++++++M.bovis (Vallee)++++++++++++M.tuberculosis (H₃₇Ra)++++++++++++Coryn. pseudotuberculosis, №2+++++++++---Coryn. pseudotuberculosis, №3+++++++++---Rhodococcus equi+++++++++---Примечание: (+) - рост; (-) - отсутствие роста

Пример 3. Для подтверждения осуществимости способа из пробы патологического материала (кусочки органов с характерными для туберкулеза изменениями) от положительно реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих животных в хозяйстве, благополучном по туберкулезу, готовили парные образцы, которые обрабатывали, как в примере 1, и помещали в термостат. Через 4-7 дней выращивания при температуре +37°С в образце, обработанном 0,5%-ным водным раствором препарата «Лесептик» в течение 3 часов, вырастали крупные белые или желтые слизистые колонии без поверхностного мицелия. При окраске по Цилю-Нильсену в мазках из колоний выявили два типа клеток. Первый тип клеток - некислотоустойчивые палочки, овальные с темно-вишневыми или темно-синими многочисленными гранулами внутри клетки. При окраске по Романовскому-Гимза вокруг клеток обнаруживали розовую капсулу. По отсутствию кислотоустойчивости и морфологическим признакам (форма клеток, наличие зерен волютина, морфология колоний) клетки идентифицировали как коринебактерии. На среде с теллуритом калия вырастали слизистые черные колонии. Идентификацию подтверждали исследованием жирнокислотного спектра клеток методом газожидкостной хроматографии (отсутствие на хроматограммах эфиров жирных кислот туберкулостеариновой кислоты, значительное содержание олеиновой кислоты (С_18:1), отсутствие высших жирных кислот и числом атомов больше 20). Второй тип клеток - крупные полиморфные кислотоустойчивые и некислотоустойчивые палочки и кокки с темно-красными зернами внутри клеток, которые идентифицировали методом газожидкостной хроматографии (выраженный пик туберкулостеариновой кислоты, низкомолекулярные эфиры жирных кислот с числом углеродных атомов от 12 до 20 и отсутствие высокомолекулярных миколовых кислот) как родококки. В образце, обработанном 2%-ным водным раствором препарата «Лесептик» в течение 15 минут, рост отсутствовал.

Пример 4. Для подтверждения осуществимости из пробы патологического материала (печень, легкие) от положительно реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих животных в хозяйстве, благополучном по туберкулезу, готовили парные образцы, которые обрабатывали, как в примере 1, и помещали в термостат. Через 5-8 дней выращивания при температуре +37°С в образце, обработанном 0,5%-ным водным раствором препарата «Лесептик» в течение 3 часов, вырастали пигментированные мелкие колонии S- или R-формы, содержавшие кислотоустойчивые полиморфные зернистые палочки и зерна, идентифицированные методом газожидкостной хроматографии (хорошо выраженный пик туберкулостеариновой кислоты и высшие миколовые кислоты) как быстрорастущие микобактерии. В образце, обработанном 2%-ным водным раствором препарата «Лесептик» в течение 15 минут, рост отсутствовал.

Пример 5. Для подтверждения осуществимости способа из пробы патологического материала (брыжеечные лимфатические узлы) от убитой с контрольно-диагностической целью коровы с положительной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих без видимых патологоанатомических изменений, характерных для туберкулеза, в хозяйстве, неблагополучном по туберкулезу, готовили парные образцы и обрабатывали, как в примере 1. В образце, обработанном 0,5%-ным водным раствором препарата «Лесептик» в течение 3 часов, в течение первых 7 дней выращивания рост колоний отсутствовал. В образце, обработанном 2%-ным водным раствором препарата «Лесептик» в течение 15 минут, через 2 недели выросли мелкие колонии белого цвета, которые окрашивали по Цилю-Нильсену и по морфологическим признакам идентифицировали как микобактерии, что подтверждали исследованием жирнокислотного спектра клеток методом газожидкостной хроматографии. По хемотаксономическим характеристикам (по соотношению на хроматограммах эфиров миколовых кислот с числом атомов углерода 22, 24, 15, 26) микобактерии идентифицировали как М.tuberculosis-bovis.

Пример 6. Для подтверждения эффективности способа в пробах патологического материала (лимфоузлы, печень, легкие) от разных половозрастных групп свиней Ильиногорского свинокомплекса (Нижегородская область) и крупного рогатого скота семи хозяйств Нижегородской и Рязанской областей выявляли нокардиоформные актиномицеты способом в соответствии с изобретением в сравнении с базовым, включающим предпосевную обработку по А.П.Аликаевой - 6% раствором серной кислоты при экспозиции 30 минут. Всего было исследовано 68 проб. После обработки патологического материала по методу А.П.Аликаевой нетуберкулезные микобактерии и нокардиоформные актиномицеты выявлены в 12 пробах (17,6%) способом в соответствии с изобретением - в 44 пробах (64,7%). При оценке сроков появления первичных колоний и скорости роста колоний установлено, что если при обработке патологического материала по методу А.П.Аликаевой первичные колонии нокардий и бытрорастущих микобактерии появлялись на 16-18 сутки, а интенсивный рост отмечался на 19-20 сутки, то при обработке патологического материала способом в соответствии с изобретением в образце, обработанном 0,5%-ным водным раствором препарата «Лесептик», эти показатели составили 2-3 и 5-8 суток соответственно. В образце, обработанном 2%-ным водным раствором препарата «Лесептик» в течение 15 минут, рост отсутствовал.

Проведенные исследования подтвердили достижение технического результата - выявление нокардиоформных актиномицетов в патологическом материале, причем обеспечивается раздельное выявление патогенных медленно растущих микобактерий и быстро растущих микобактерий, родококков и коринебактерий, что позволяет проводить ускоренную первичную индикацию и дифференциацию положительных реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих, вызываемых микобактериями туберкулеза, от положительных реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих, вызываемых коринебактериями, родококками и нетуберкулезными микобактериями.

Источники информации

1. Ветеринария, 1996, №3. С.28.

2. Туберкулез сельскохозяйственных животных / Под ред. Шишкова В.П., Урбана В.П. - М.: Агропромиздат, 1991. - C.114-118.

3. Ветеринария, 1984. - №5. - С.67-68.

4. Патент RU 2190220C1, 27.09.2002 - прототип.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарной микробиологии. Из пробы патологического материала готовят парные образцы, первый образец заливают 0,5%-ным, второй образец - 2,0%-ным водным раствором препарата «Лесептик» в объемном соотношении 1:2 с экспозицией 3 ч и 15 мин соответственно при комнатной температуре. Затем раствор препарата «Лесептик» сливают, дважды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, готовят суспензию, которую засевают на плотные яичные среды и выращивают при температуре +37°С. Изобретение обеспечивает ускоренную первичную индикацию и дифференциацию положительных реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих, вызываемых микобактериями туберкулеза, от положительных реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих, вызываемых коринебактериями, родококками и нетуберкулезными микобактериями. 1 табл.

Способ бактериологического выявления нокардиоформных актиномицетов, включающий предпосевную обработку пробы патологического материала водным раствором препарата «Лесептик» с выдержкой при комнатной температуре с последующим посевом на плотную питательную среду, отличающийся тем, что из пробы патологического материала готовят парные образцы, первый образец заливают 0,5%-ным, второй образец - 2,0%-ным водным раствором препарата «Лесептик» в объемном соотношении 1:2 с экспозицией 3 ч и 15 мин соответственно, после чего раствор препарата «Лесептик» сливают, образцы отмывают в изотоническом растворе натрия хлорида и готовят суспензию.