Способ получения полисахаридов, обладающих слабительным действием Советский патент 1992 года по МПК A61K35/80 

Изобретение относится к фармецевти- ческой промышленности и касается получения биологически активных веществ из растительного сырья.

Наиболее близким по технологии и биологическому - слабительному действию к альгинату аммония является способ получения суммы полисахаридов обволакивающего и мягчительного действия из морской капусты (L, saccharina L.), лежащей в основе получения препарата Ламинарид. Данный способ заключается в экстракции Laminaria saccharina водой при 70-90°С в соотношении компонентов 1:30, далее полученный экстракт фильтруют, упаривают до 1 /5 первоначального объема, осаждают целевой продукт равным объемом спирта и выдерживают смесь 2 ч. Выпавший осадок полисахаридов отфильтровывают. Образовавшийся осадок промывают ацетоном, затем 96%-ным спиртом и высушивают. Выход полисахаридов составляет 3,3% к сырью.

Указанный способ характеризуется низким выходом целевого продукта за счет щадящего режима экстракции и недостаточного объема этанола, используемого для обработки экстракта (соотношение экс- тракт:этанол - 1:1), и низкой биологической активностью.

Цель изобретения - повышение выхода и специфической активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения альгината

СО

а ел о

ю

мония, обладающего слабительным действием, из беломорской ламинарии, представляющего собою естественную смесь двух видов ламинарий (Laminaria saccharina et Laminaria digitata), осуществляют путем промывки сырья 1%-ным раствором соляной кислоты при 30°С в течение 1 ч, экстрагирования сырья 1%-ным раствором оксалата аммония при соотношении сырье:экстрагент 1:20 при 20°С в течение 5 мин, при измельчении и перемешивании, мацерируют при 20°С в течение 20 ч с последующим трехкратным экстрагированием при 70°С в течение 30 мин, упариванием экстракта до удельного веса 1,06-1,09, обработкой экстракта 96%-ным этанолом в соотношении экстракт:этанол 1:3, фильтрацией, промывкой и сушкой целевого продукта.

При использовании способа вихревой экстракции в мельэкстракторе одновременно осуществляются два процесса: измельчение и экстракция, причем благодаря наличию двух пар ножей, расположенных горизонтально и под углом 45° к рабочей оси прибора, измельчение сырья осуществляется в двух плоскостях - горизонтальной и под углом 45°, в результате чего происходит тонкое измельчение сырья до 5 мм с разрывом клеточных стенок, что способствует дополнительно извлечению целевого продукта из клеточного сока, а следовательно, увеличению выхода продукта (табл. 1).

Кроме того, предварительная промывка сырья 1%-ным раствором соляной кислоты и использование в качестве экстрагента оксалата аммония способствуют получению чистого альгината аммония, практически беззольного.

Наиболее важные свойства альгинатов, которые используются во многих отраслях, следующие: загуститель, стабилизатор, об- разователь геля и пленки.

Предлагаемый способ увеличивает выход целевого продукта в 9,5 раз для беломорской ламинарии и в 9,4 раза для дальневосточной ламинарии.

Анализ полученного альгината аммония проводили качественно с помощью цветных реакций, по величине рН раствора альгината аммония, методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), по реакции выделения аммиака, содержанию общей золы и количественно - методом обратного кислотно-основного титрования.

Результаты идентификации альгината аммония.

I. С помощью цветных реакций.

1.1 Реакция Молиша. К 1 мл 0,5% водного раствора альгината аммония добавляли 2 капли спиртового раствора а-нафтола, затем по стенке пробирки и смеси осторожно приливали 1 мл концентрированной серной кислоты так, чтобы кислота не

смешивалась с водным слоем, Появление красно-фиолетового кольца на границе двух слоев указывало на присутствие углеводной группы.

1.2, Нафторезорционовая проба Толленса.

К 1 мл 0,5% водного раствора альгината аммония добавляли 1 мл 1 %-ного спиртового раствора нефторезорцина и такой же объем концентрированной соляной кислоты.

Смесь осторожно нагревали до кипения и кипятили 1 мин, затем охлаждали и взбалтывали с эфиром. Эфирный слой окрашивался в фиолетовый цвет, что свидетельствовало о наличии уроновых кислот.

II. По величине рН 0,5% водного раствора альгината аммония. Определяли потен- циометрически: рН раствора составил 7,1.

III.Методы ТСХ.

После кислотного гидролиза альгината аммония (100°С, 8 ч) уроновые кислоты разделяли при двукратном хроматографирова- нии на слое, приготовленном из порошка целлюлозы марки MN 300. Система растворителей: изопропанол - пиридин -ледяная уксусная кислота - вода (8:8:1:4). Проявитель - нафторезорцин. Обнаружены 2 пятна с Rf 0,25 и Rf 0,18, которые в сравнении со свидетелями идентифицированы как маннуроновая и гулуроновая кислоты, со- держащиеся в молекуле альгината аммония.

IV.По выделению аммиака.

К 0,2 г альгината аммония добавляют 10

капэль 20%-ного раствора едкого натра,

при этом выделяется газообразный аммиак,

окрашивающий синюю лакмусовую бумагу в

красный цвет.

V.По содержанию общей золы, %. Исследуемый альгинат аммония содержит всего 0,04% золы, что свидетельствует о высокой чистоте целевого продукта.

VI.Количественное определение альгината аммония проводили методом обратного титрования раствором гидроксида

натрия избытка серной кислоты, оставшейся после взаимодействия ее с альгинатом аммония. Содержание альгината аммония составило 87,12%.

Изучена зависимость выхода альгината аммония от ряда технологических параметров (табл. 2-7).

Зависимость температуры экстракции и выхода альгината аммония представлена в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что при 20°С обеспечивается наибольший выход альгината аммония.

Зависимость частоты перемешивания сырья и выхода альгината аммония представлена в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что оптимальной частотой перемешивания сырья является 8000 об/мин, так как при этом обеспечивается максимальный выход альгината аммония.

Зависимость времени перемешивания сырья и выхода альгината аммония представлена в табл. 4.

Из табл. 4 следует, что наиболее оптимальной продолжительностью перемешивания сырья является 5 мин, при этом обеспечивается максимальный выход альгината аммония.

Зависимость продолжительности мацерации и выхода альгината аммония представлены в табл. 5.

Из табл. 5 следует, что оптимальная продолжительность мацерации составляет 20 ч, так как при этом обеспечивается максимальный выход альгината аммония.

Результаты влияния соотношения сырье:оксалат аммония на выход альгината аммония представлены в табл. 6.

Из табл. 6 следует, что оптимальным соотношением сырье: 1 %-ный раствор окса- лата аммония является 1:20, так как при этом обеспечивается максимальный выход альгината аммония.

Результаты влияния соотношения экстракт: 96%-ный этанол при осаждении целевого продукта на выход альгината аммония предлагаемым способом представлены в табл. 7.

Из табл. 7 видно, что наиболее полное осаждение целевого продукта (34,15%) происходит при использовании соотношения экстракт: 96%-ный этанол 1:3.

Для сравнения изучено влияние различных соотношений экстракт: 96%-ный этанол на выход ламинарида в способе, принятом за прототип.

Результаты влияния соотношения экстракт: 96%-ный этанол при осаждении целевого продукта на выход ламинарида по способу-прототипу представлены в табл. 8.

Из табл. 8 следует, что в способе-прототипе наиболее оптимальное соотношение экстракт: 96%-ный этанол при осаждении ламинарида 1:3, а при соотношении 1:1 выход ламинарида является низким.

П р и м е р 1. К 100 г беломорской водоросли (Laminaria saccharina и L. digitata) приливают 400 мл 1 %-ного раствора соляной кислоты и выдерживают 1 ч при 30°С для освобождения водорослей от растворимых минеральных и органических веществ. Кислый экстракт сливают. Остаток водорослей промывают от следов хлорид- ионов (до отрицательной качественной реакции с нитратом серебра на хлорид-ион в промывных водах). Далее водоросли помещают в Мельэкстрактор, приливают 2 л 1 %-ного раствора оксалата аммония и перемешивают в приборе при частоте переме0 шивания 8000 об/мин в течение 5 мин (при этом одновременно с измельчением сырья происходит экстракция оксалатом аммония). Затем продолжают экстрагирование без перемешивания в течение 20 ч при 20°С,

5 после чего смесь нагревают до 70°С и выдерживают при этой температуре 30 мин. Экстракт (I) фильтруют сначала через марлю, затем - фильтровальную бумагу. И снова к оставшимся водорослям приливают

0 1 %-ный раствор оксалата аммония в объеме 0,5 л, экстрагируют при 70°С в течение 30 мин, экстракт фильтруют через марлю, затем - фильтровальную бумагу, экстракт (II) соединяют с экстрактом (I). Затем третий

5 раз проводят экстракцию при 70°С в течение 30 мин. Полученный третий экстракт соединяют с первым и вторым. Объединенный экстракт упаривают под вакуумом при 50°С до сиропообразного состояния (удель0 ный вес 1,06-1,09). Из экстракта альгинат аммония осаждают 96%-ным этанолом в соотношении экстракт:этанол 1:3, Осадок отделяют фильтрованием через бумажный фильтр (красная лента), промывают спир5 том, затем эфиром (до получения бесцветного промывного спирта и эфира), сушат на воздухе.

Выход альгината аммония составил 34,15%, т.е. 34,15 г из 100 г сырья.

0 Целевой продукт - альгинат аммония - из беломорской ламинарии представляет собой порошок бледно-желтого цвета, без запаха, слизистого вкуса. Медленно растворим в воде. Нерастворим в органических

5 растворителях: этанол, бензол, ацетон и др. Полученный альгинат аммония практически не имеет зольности (0,04%). Продолжительность способа 1 сут.

Пример 2. К 100 г беломорской

0 ламинарии (L. saccharina et L digitata) приливают 400 мл 1 %-ного раствора соляной кислоты и выдерживают 1 ч при 30°С. Кислый экстракт сливают. Остаток водорослей промывают от следов хлорид-ионов. Далее

5 водоросли помещают в Мельэкстрактор, приливают 1 л 1 %-ного раствора оксалата аммония и перемешивают при частоте перемешивания 6000 об/мин в течение 3 мин. Затем продолжают экстрагирование без перемешивания втечение 15ч при 10°С, после

чего смесь нагревают до 70°С и выдерживают при этой температуре 30 мин. Экстракт (I) фильтруют через марлю, затем через фильтровальную бумагу. К оставшимся водорослям снова приливают 0,5 л 1 %-ного раствора оксалата аммония, экстрагируют при 70°С в течение 30 мин. Второй экстракт фильтруют и аналогично проводят третью экстракцию (при 70°С в течение 30 мин). Объединенные экстракты упаривают под вакуумом при 50°С (до удельного веса экстракта 1,06-1,09), Из экстракта альгинат аммония осаждают 96%-ным этанолом в соотношении экстракт:этанол 1:3. Осадок фильтруют через бумажный фильтр, промывают спиртом, эфиром, сушат на воздухе.

Выход алыината аммония составил 32,74%, т.е. 32,74 г из 100 г сырья.

Пример 3. К 100 г беломорской водоросли (L. saccharina et L digitata) приливают 400 мл 1 %-ного раствора кислоты и выдерживают 1 ч при 30°С. Кислый экстракт сливают. Остаток водорослей промывают от следов хлорид-ионов. Далее водоросли помещают в Мельэкстрактор, приливают 3 л 1 %-ного раствора оксалата аммония и перемешивают при частоте перемешивания 10000 об/мин в течение 7 мин, затем продолжают экстрагирование без перемешивания в течение 25 ч при 30°С, после чего смесь нагревают до 70°С и выдерживают при этой температуре 30 мин. Экстракт (I) фильтру ют через марлю, затем - через фильтровальную бумагу. К оставшимся водорослям снова приливают 0,5 л 1%-ного раствора оксалата аммония, экстрагируют при 70°С в течение 30 мин. Второй экстракт фильтруют и аналогично проводят третью экстракцию (при 70°С в течение 30 мин). Объединенные экстракты упаривают под вакуумом при 50°С (до удельного веса экстракта 1,06-1,09). Из экстракта альгинат аммония осаждают 96%-ным этанолом в соотношении экстракт:этанол 1:3. Осадок фильтруют через бумажный фильтр, промывают спиртом, эфиром, сушат на воздухе.

Выход альгината аммония составил 34,14%, т.е. 34,14 г на 100 г сырья.

Пример4(с использованием сырья, использующегося в способе-прототипе). К 100 г Laminaria saccharina приливают400 мл

1%-ного раствора соляной кислоты и далее поступают аналогично примеру 1.

Выход целевого продукта - альгината аммония 31,06%, т.е. 31,06 г из 100 г сырья.

Пример 5 (способ-прототип). 50 г слоевищ Laminaria saccharina измельчают на частицы размером примерно 0,5 см, помещают в коническую колбу вместимостью

2л, заливают 1,5 л дистиллированной воды.

Колбу с содержимым нагревают на кипящей водяной бане, при этом температура смеси в колбе составляет 85°С. Далее экстракт фильтруют через бумажный фильтр, упаривают до 1/5 первоначального объема (примерно 200 мл), осаждают целевой продукт 96%-ным этанолом в соотношении экс- тракт:этанол 1:1, выдерживают смесь 2 ч. Осадок фильтруют через бумажный фильтр,

0 затем промывают последовательно ацетоном, 96%-ным этанолом и сушат.

Выход полисахаридов составляет 3,3%, т.е. 1,65 г из 50 г сырья.

Пример6(с использованием сырья,

5 использующегося в предлагаемом способе). 50 г слоевищ смеси ламинарий L. saccharina и L. digitata измельчают на частицы размером примерно 0,5 см, далее поступают аналогично примеру 5.

0Выход полисахаридов составляет 3,6%,

т.е. 1,8 г из 50 г сырья.

Изучение острой токсичности альгината аммония, полученного из водорослей, проведено по методу Кербера на 36 белых мы5 шах массой 30-40 г при внутрибрюшинном введении вещества. Согласно методическим рекомендациям Фармакологического комитета МЗ СССР (М., 1985) максимально допустимым количеством жидкости для

0 внутрибрюшинного введения мышам массой 20-40 г является 1,0 мл. В этой связи исследуемое вещество вводилось мышам из расчета 1000 мг/кг в объеме 1,0 мл. После одноразового введения за состоянием жи5 вотных наблюдали 14дней. За время наблюдений гибели животных не отмечалось, что позволяет определить для альгината аммония SDso -1000 мг/кг.

Согласно классификации токсических

0 веществ исследуемое вещество следует отнести к группе малотоксичных веществ.

Слабительное действие альгината аммония, полученного из беломорских водорослей, проводилось в сопоставлении с

5 действием официального слабительного препарата ламинарида на белых мышах известными методами. В одном случае о слабительной активности веществ судили по величине пассажа (мм) по кишечнику с ис0 пользованием метки. Метка осуществлялась путем введения зондом в желудок животного 5% взвеси активированого угля за 20 мин до перорального введения исследуемых веществ в дозе 200 мг/кг в обьеме

5 0,4 мл физиологического раствора. Животных забивали через 2 ч декапитированием и замеряли степень продвижения метки (активированного угля) вдоль кишечника. В других опытах о слабительном действии исследуемых веществ судили по величине дефекации животных (массе и консистенции фекалий), помещенных в специально для этих целей клетки. В этом случаеждивотным перорально вводились исследуемые вещества в дозе 200 мг/кг в объеме 0,4 мл физиологического раствора с последующим через 24 ч взвешиванием фекалий (г) и описанием их консистенции. В выборе дозы исследуемых веществ исходили из рекомендаций по применению официального сла- бильного препарата ламинарида. В контрольных опытах в соответствующем количестве вводился животным физиологический раствор. Результаты опытов обрабатывались методом вариационной статистики.

Как следует из табл. 8, величина пассажа по кишечнику при введении всех исследуемых веществ была выше, чем в контрольных опытах (на 44,8-50,4%, р 0,01). Причем наиболее выраженное увеличение пассажа наблюдалось в случае введения альгината аммония (на 50,4%, р 0,001), однако достоверного различия по сравнению с эталоном сравнения (ламинаридом) не отмечалось.

Слабительный эффект альгината аммония получил подтверждение в опытах с определением величины дефекации (табл. 9). В этих опытах увеличение массы фекалий под влиянием приема альгината аммония по сравнению с контролем достигало 166,6% (р 0,001) и статистически достоверно превосходило массу фекалий у животных, получавших ламинарид на 66,6%. Однако у животных, получавших альгинат аммония, фекалии становились кашицеобразными и даже жидкими.

Величина пассажа по кишечнику при введении альгината аммония представлена в табл. 9.

Величина дефекации при введении альгината аммония представлена в табл. 10.

Таким образом, полученные результаты экспериментов подтверждают, что исследованный альгинат аммония обладает значительным слабительным действием, превосходящим аналогичный эффект официального слабительного препарата ламинарида. По типу своего действия альгинат аммония следует отнести к средствам, вызывающим увеличение объема и разжижение кишечного содержимого, хотя ему свойственно в определенной мере также

вызывать усиление перистальтики с увеличением пассажа содержимого по кишечнику.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение целевого продукта,

обладающего выраженным слабильным действием, с высоким выходом, чистотой, с использованием в качестве сырья помимо Laminaria saccharina и L digitata.

20

Формула изобретения

Способ получения полисахаридов, обладающих слабительным действием, путем промывки слоевища морской капусты, его

экстракции, фильтрации экстракта, осаждения из фильтрата целевого продукта 96%- ным этанолом, фильтрации, промывки осадка и его сушки, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и специфической активности, в качестве сырья используют смесь слоевища Laminaria saccharina L и L. digitata, промывку сырья осуществляют 1%-ным раствором соляной кислоты, а экстрагируют 1 %-ным раствором

оксалата аммония при соотношении сырье - экстрагент 1:20 в течение 5 мин. при одновременном измельчении и перемешивании сырья, далее сырье мацерируют в течение 20 ч с последующим двукратным экстрагированием 1%-ным раствором оксалата аммония при 70°С в течение 30 мин, объединенные экстракты упаривают до удельного веса 1,06-1,09, а осаждение этанолом проводят при соотношении сырье этанол 1:3.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается получения биологически активных веществ из растительного сырья. Цель изобретения - повышение выхода и специфической активности целевого продукта. Способ осуществляется путем промывки естественной смеси двух видов ламинарий (Laminaria saccharina и L. digitata L) 1%-ным раствором соляной кислоты при 30°С в течение 1 ч, экстрагирования сырья 1%-ным раствором оксалата аммония при соотношении сырье - экстра- гент 1:20 при 20°С в течение 5 мин при измельчении и перемешивании, мацериро- вания при 20°С в течение 20 ч с последующим трехкратным экстрагированием при 70°С в течение 30 мин, упаривания экстракта до удельной массы 1,06-1,09, осаждения целевого продукта из полученного экстракта 96%-ным этанолом в соотношении экстракт-этанол 1:3, фильтрации, промывки и сушки целевого продукта. Заявленный способ обеспечивает увеличение выхода целевого продукта в 9,5 раз и повышение специфической активности (по сравнению с контролем активность ламинарида выше на 66,6%, а активность алыината аммония - на 166,6%). 10 табл. Ьо С

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 9

Таблица 10