Способ получения коллагеновых микроносителей Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

сл

с

Использование: биотехнология, культивирование клеток. Сущность изобретения: зольный спилок шкур крупного рогатого скота подвергают щелочно-солевой обработке в течение 120-144 ч, образующуюся коллагенсодержащую массу пропускают через щелевой гомогенизатор при скорости вращения винта 80-140 мин , затем подают в осадитель через фильеры с диаметром 0,5-1,5 мм при ско р о сти вращения винта мешалки 1200-4000 мин . а далее осуществляют модификацию коллагена 0,85-0,90%-ным спиртовым раствором/ -5- (нитрофурил-2)-акролеина. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения колла- геновых микроносителей, используемых в качестве субстрата для культивирования клеток.

Известен способ получения коллагено- вых микроносителей, заключающийся втом, что кожу теленка размалывают, размол помещают последовательно в5%-ный раствор NaCI, 1%-ный раствор бикарбоната натрия (для удаления растворимых компонентов) и воду. Далее в воду с размолом вводят пепсин в количестве 0,5% от массы размола, затем добавляют соляную кислоту до рН 3. Нерастворимый коллаген в этих условиях растворяется при 20-25°С и перемешивании. По окончании процесса растворения раствор коллагена фильтруют через фильтровальную бумагу, миллипоровские фильтры 1 мкм и 0,45 мкм. Фильтрат

подщелачивают до рН 11 и оставляют на ночь. После этого рН снижают до 7,0-7,5 (при этом коллаген преципитируется) и осадок промывают водой. Затем преципитат вновь растворяют в разведенной соляной кислоте при рН 3, вновь преципитируют подщелачиванием раствора до рН 7-7,5 и отделяют центрифугированием.

Химическое модифицирование полученного коллагена проводят путем обработки его янтарным ангидридом. При атом свободные аминогруппы коллагена превращаются в свободные карбоксильные группы и коллаген приобретает отрицательный заряд. Степень замещения аминогрупп на карбоксильные составляет 80-90%. Воз-, можно дальнейшее модифицирование коллагена обработки его метиловым спиртом в присутствии кислого катализатора. При этом метиловые группы спирта взаимодейЧ W 00 00 СЛ

ствуют с карбоксильными группами коллагена, в результате чего отрицательные заряды, создаваемые карбоксильными группами, гасятся и коллаген приобретает положительный заряд. Степень метилиро- вания составляет 60-80%.

Полученный описанными способами химически модифицированный коллаген растворяют в разбавленной соляной кислоте (рН 3) и получают 0,3%-ный раствор колла- гена. Эти растворы фильтруют через милли- поровский фильтр 0,45 мкм и разливают по чашкам Петри. После высушивания асептически на воздухе чашки облучают в течение 1 ч ультрафиолетом для сшивки коллагена. Затем коллаген-покрытие чашки трижды промывают раствором Хэнкса.

Культивирование клеток на полученных коллагеновых микроносителях осуществля- ют в присутствии эмбриональной коровьей сыворотки или фибронектина. Придание заряда поверхности коллагена улучшает при- крепляемость клеток к субстрату и эффективность их роста. Кроме того, при культивировании в этом случае клетки снимаются с поверхности с высокой степенью эффективности и без повреждения.

Однако описанный способ получения коллагеновых микроносителей отличается большой сложностью технологического процесса, которая состоит в необходимости многократной (4-кратной) фильтрации раствора коллагена через фильтры с малым диаметром пор.

Известен способ получения коллагеновых микроносителей для культивирования клеток путем щелочно-солевой обработки зольного спилка шкур крупного рогатого скота в течение 96-100 ч с последующим выделением коллагена в среду ацетона и модифицированием его 0,6-0,8%-ным спиртовым раствором (нитрофурил-2) акролеина в течение 6-15 ч.

Однако культивирова ние клеток на пол- ученных этим способом микроносителях по- зволяет достичь величины индекса пролифирации лишь на 4-е сутки 2,3-3,0. Кроме того, получают коллаген в виде пле- нок, которые обладают недостаточным ра- бочим объемом, и для более удобного способа использования их необходимо измельчать до требуемых размеров, что является технологически трудновоспроизводимым.

Целью изобретения является повышение качества коллагеновых микроносителей при сокращении длительности процесса.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения коллагенновых микроносителей, заключающемуся в том.

что зольный спилок шкур крупного рогатого скота подвергают щелочно-солевой обработке в течение 120-144 ч, обрзующуюся коллагенсодержащую массу пропускают через щелевой гомогенизатор при скорости вращения винта 80-140 об/мин, затем подают массу через фильеры с диаметром отверстий 0,5-1,5 мм при скорости вращения мешалки 1200-400 об/мин на осаждение в среде ацетона, а модификацию выделенного коллагена ведут 0,85-0,90%-ным спирто- вым раствором ft -5-(нитрофурил-2) акролеина в течение 4-6 ч.

Полученные предлагаемым способом коллагеновые микроносители при использо- вании в процессе культивирования позволяют повысить индекс пролифирации с 2,3-3,0 (известный способ) до 7-8,7.

П р и м е р 1. Зольный спилок шкур крупного рогатого скота подвергают фосфатной обработке 0,6%-ным раствором дву- замещенного фосфата натрия при рН 8,9 в течение 12 ч. Затем в течение 120 ч подвергают щелочно-солевой обработке (150 г NaOH на 1 л 1 н, раствора безводного сульфата натрия), а затем 1 н. раствором сульфатанатрия.Послеэтого коллагенсодержащую массу промывают проточной водой для удаления ионов

S 0$ и нейтрализуют 0,02 н. раствором соляной киелоты. Далее коллагеновую массу с содержанием 1,5% коллагена винтовым прессом при скорости вращения винта 80 об/мин под давлением 0,3 МПа подают через щелевой гомогенизатор на фильерный комплектосадителя, над которым на расстоянии 1 мм вращается лопастная мешалка со скоростью 1200 об/мин. Коллагеновая масса, проходя через отверстия диаметром 0,5 мм, осаждается в ацетон, разбиваясь на мелкие частицы за счет вращения мешалки. Обводненную массу с содержанием коллагена 30% подают на повторное осаждение свежей порцией ацетона, затем на центрифугу, где содержание белка увеличивается до 75%. После центрифугирования проводят сушку коллагена и расфракционирова- ние. Затем полученные частицы неопределенной формы модифицируют 0,85 %-ным спиртовым раствором /Ј-5-(нит- рофурил-2) акролеина.

Режимы получения и свойства микроносителей по примерам 1-8 даны в таблице.

Таким образом, в сравнении с известным предлагаемый способ позволяет достичь повышения качества коллагеновых микроносителей при сокращении длительности процесса.

Формула изобретения Способ получения коллагеновых микроносителей, включающий щелочно-солевую обработку зольного спилка шкур крупного рогатого скота, осаждение образующейся коллагенсодержащей массы в среде ацетона с последующей модификацией коллагена, отличающийся тем, что. с целью повышения качества целевого продукта при сокращении длительности процесса, щелочно-солевую обработку проводят в течеПримечание Контроле- культивирование осуществляются микроносителях полученных по известному способу и иа биомикроносителе Цитодекс - 3

0

ние 120-144 ч, образующуюся коллагенсо- держащую массу перед осаждением в среде ацетона пропускают через щелевой гомогенизатор при скорости вращения винта 80- 140 , затем подают в осадитель через фильеры с диаметром 0,5-1,5 мм при скорости вращения мешалки 1200-400 мин . а модификацию коллагена ведут 0,85-0,90%- ным спиртовым раствором /9-5-{нитрофу- рил-2) акролеина.