Способ выделения глутамина Советский патент 1992 года по МПК C12P13/14 

(Л

С

Использование: в биотехнологии при получении глутамина, применяемого в пищевой и медицинской промышленности. Сущность изобретения: культуральную жидкость нейтрализуют при перемешивании фосфорной кислотой и фильтруют. Обессоленный фильтрат пропускают через колонку, заполненную катионитом КУ 2x8 в Н+-форме. Отсорбированный глутамин элю- ируют с колонки раствором щелочи и затем выделяют его кристаллизацией из щелочного элюата. Выход продукта 75 - 80%, чистота не менее 98,5%.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения глутамина, исполь- зуемого в пищев.ой и медицинской промышленности, конкретно выделения его из кулътуральной жидкости.

Известен способ ионообменного выделения глутамина, заключающийся в том, что культуральную жидкость подкисляют HCI до рН 3,5 и фильтруют. Фильтрат пропускают через колонну с сильнокислотным катио- нйтом для сорбции глутамина, последний элюируют слабым раствором аммиака, который отпаривают под вакуумом; раствор концентрируют при дальнейшем упаривании, очищают углем и дважды кристаллизуют из спирта.

Недостатки этого способа состоят в том, что будучи неустойчивым в кислой среде глу- тамин частично разлагается в процессе сорбции, так как рН в фазе сильнокислотного катиона достигает0,5 - 0,7. Упаривание раствора также приводит к частичному разложению глутамина. В результате перечисленных факторов в процессе очистки теряют 30-40% препарата.

Известен способ выделения глутамина- та из растворов, состоящий в том, что раствор глутамина очищают от неорганических солей в электродиализаторе при рН 5,5 - 5,6 и затем кристаллизуют.

Однако электродиализ не освобождает глутамин от органических и пигментных примесей культуральной жидкости, которые препятствуют кристаллизации. Поэтому данный метод не может самостоятельно быть использован в качестве промышленного способа производства глутамина.

Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения глутамина, предусматривающийионообменнуюколоночную хроматографию фильтрата культуральной жидкости, очистку от примеVI

4 О ю

сей полученного глутаминсодержащего элюата и кристаллизацию целевого продукта.

Основной недостаток способа состоит в многостадийности процесса и больших по- терях целевого продукта вследствие разложения в процессе сорбции на катионите и выпарки.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения глутамина, предусматривающему ионообменную колоночную хроматографию фильтрата культу- ральной жидкости, очистку от примесей полученного глутаминсодержащего элюата и кристаллизацию целевого продукта, после очистки из глутаминсодержащего элюата сорбируют глутамин на смоле Ку 2x8 в Н+- форме и элюируют его раствором щелочи, а кристаллизацию проводят непосредственно из щелочного элюата.

Сущность предложенного способа состоит в следующем.

Культура л ьную жидкость нейтрализуют при перемешивании фосфорной кислотой до рН 5,5 - 6. При этом суспензия расслаивается и ее фильтруют. Фильтрат пропускают через колонну с катионитом в Н+-форме и глутамин сорбируется вместе с посторонними катионами. Затем через колонну пропускают 2,5 - 3,5%-ный аммиак и получают элюат глутамина, не содержащий солей. Аммиак отпаривают под вакуумом. Нативный раствор можно обессолить другим методом - пропуская его с высокой скоростью через ряд последовательно соединенных пар: ка- тионит Ку 2x20 в Н+-форме и анионит ЭДЕ- 10 п в ОНГформе. В этом случае происходит и частичное осветление нативного раствора. Расход смолы в обоих вариантах обессо- ливания почти одинаков. Обессоленный раствор пропускают через осветляющую колонну с ионитом ИА-1 и затем через колонну с катионитом Ку 2x8 в Н+-форме, который полностью насыщается глутамином. Последний элюируют 1 - 2 н.щелочью, причем рН элюата держится на уровне 5,6 - 6,0, что соответствует изоэлектрической точке глу- тамина. Поскольку концентрация глутамина в элюате превышает в 6 - 8 раз его растворимость, а раствор не содержит посторонних примесей, начинается кристаллизация. Выпавшие белые иглообразные кристаллы центрифугируют до влажности 18 - 20%. Чистота продукта не менее 98,5%. Конец сбора глутамина при элюции - бедную фракцию вместе с маточником присоединяют к обессоленному раствору перед осветлением. Общий выход продукта 75 - 80%.

Пример1.5л культуральнойжидкости с концентрацией глутамина 38 г/л заливают в емкость с мешалкой и постепенно вводят концентрированную фосфорную кислоту (55 мл) до рН 6,0. В результате суспензия расслаивается за счет превращения мела в фосфат кальция. Суспензию фильтруют на нутч-фильтре и промывают осадок 200 мл воды. Получают 320 г осадка влажностью 62% и 4,9 л фильтрата с концентрацией глутамина 35 г/л и содержанием посторонних катионов 700 мг-экв/л. Для обессоливания используют систему последовательно соединенных стеклянных колонн емкостью 10 мл каждая. Соединялись последовательно пары: катионит Ку 2x20 в Н+-фрме - анионит ЭДЕ-10 п в форме. Скорость раствора в системе 5,0 л/ч. Глутамин не сорбируется на смоле Ку 2x20 и, учитывая малое время контакта (3-4 мин) не разлагается в зоне ионита. Сохранность глутамина подтверждается методом тонкослойной хроматографии. Раствор с колонн вытесняется водой. Начало и конец сбора обессоленного нативного раствора согласуют с коэффициентом рефракции, который должен в начале достигать значения 1,334 и в конце опускаться до 1,335. После обессоливания получают 6,1 л раствора с концентрацией глутамина 26,6 г/л и солей 25 мг-экв/л. Затем его пропускают со скоростью 4 объема через стеклянную колонну емкостью 4 мл со смолой ИА-1 в С :форме. Сбор осветленного раствора контролируют также как при обессолива- нии.Получают 6,5 л бесцветного раствора с концентрацией глутамина 24,2 г/л. Раствор пропускают через ионообменную колонну емкостью 600 мл со смолой Ку 2x8 в Н+-фор- ме. Глутамин на выходе с колонны контролируют количественно методом ТСХ. В процессе сорбции глутамин полностью заполняет колонну без проскока в фильтрат. Колонну промывают одним объемом воды и элюируют 1 л 1 н. раствора щелочи. Сбор богатой фракции начинают при значении коэффициента рефракции 1,335 и заканчивают при значении 1,338. Получают 930 м раствора глутамина с рН 6,1 и концентрацией 158 г/л. Далее отбирают бедную фракцию до значения 1,334. Всего собирают 170 мл бедной фракции с концентрацией глутамина 35 г/л. Богатая фракция охлаждается до +5°С и через 10 ч из нее выпадают кристаллы. Их отжимают на центрифуге. Получают 160 г кристаллов с влажностью 190. Продукт подсушивают при 30°С под вакуумом до влажности 1 %. В итоге получают 131 г препарата с содержанием глутамина

98,5%. Продукт мало отличается по внешнему виду, физико-механическим и химическим характеристикам от препарата фирмы Серва. Выход от исходного количества глутамина 70%. Но поскольку 780 мл маточ- ника с концентрацией глутамина 22 г/л и 170 мл бедной фракции направляются снова в процесс на стадии осветления нативно- го раствора и не являются потерями, реальный выход продукта составляет 80%.

Пример2.5л культуральной жидкости с активностью 36 г/л обрабатывают и фильтруют как в примере 1, получив 4,8 л натив- ного раствора с концентрацией глутамина 34 г/л. Раствор пропускают со скоростью 2,5 л/ч через стеклянную колонну диаметром 7 см, высотой 65 см, в КОТОРУЮ было загружено 2,5 л смолы Ку 2x8 в форме. В фильтрате глутамина не обнаружено. Элюцию глутамина осуществляют 2,5%- ным раствором аммиака в количестве 3 л. Получают 2,6 л раствора с рН 10,8, концентрацией глутамина 46 г/л и содержанием посторонних катионов 20 мг-экв/л. Раствор упаривают до 1,5 л и концентрации 92 г/л и пропускают через колонну емкостью 400 мл со смолой ИА-1 в Cl-форме, Получают 1,8 л полностью обесцвеченного раствора с концентрацией глутамина 74 г/л. Осветленный

раствор пропускают до полного поглощения глутамина через колонну с 600 мл смолы Ку 2x8 в Н+-форме. Глутамин элюируют 0,9 л 1 н.раствора щелочи. Собирают 780 мл богатой фракции с концентрацией 155 г/л и 220 мл бедной фракции с концентрацией 36 г/л. После кристаллизации глутамина из богатой фракции получают 103 г сухих кристаллов чистоты 98,5% с выходом 57% от исходного количества. 280 мл бедной фракции с концентрацией 38 г/л и 67 мл маточника с концентрацией 27,8 г/л возвращают в процесс. Таким образом, полный выход продукта 72%.

Формула изобретения Способ выделения глутамина, предусматривающий ионообменную колоночную хроматографию фильтрата культуральной жидкости, очистку от примесей полученного глутаминсодержащего элюата и кристаллизацию целевого продукта, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, после очистки из глутаминсодержащего элюата сорбируют глутамин на смоле Ку 2x8 в Н+-форме и элюируют его раствором щелочи, а кристаллизацию проводят непосредственно из щелочного элюата.