Способ выделения -триптофана Советский патент 1980 года по МПК C12D13/06 

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ L-ТРИПТОФАНА

.,,r..-,.-,rr J:л:-.,---Л /

3t5«iiB.r--

..

iiiSu J iuJt .,.... - ; 1 Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу вьщеления L-триптофана из растворов. Известен способ выделения L-триптофана с помощью активированного ; угля . Однако этот способ малоэффективен и имеет существенные недо;. статки,связанные, например, с трудностью десорбции L-триптофана с активированного угля. ; . Известен также ионообменный метод выделения L-триптофана с использованием синтетических ионитов 23. К не достаткам указанного метода можно от нести то, что в нем предусмотрена Очистка триптофана лишь от других аминокислот, а сорбционная емкость сорбентов по отношению к тригггофану используется неэффективно. Наиболее близким техническим ре( рм Г Й сущности и достигае . . у , мому. эффектуявляется способ вьщеле / . НИИ L-трйптофана из растворов nvreM йорбции его на ионообменных смолах. получЕенного элюата и кри T iTEffiflwasffiiim Ip. - . Й5 ° ШзаййОйу способу триптофан Эорбиру10т 11а п6лйстирольном 5$ ьфокатионите или высокоосновном анионите. Примесные аминокислоты удаляют . со смолы пропусканием раствора минеральной соли. Десорбируют триптофан раствором щелочи или аммиака (в случае катиОнитов) или минеральными кислотами (в случае анионитов).L-триптофан выделяют из элюатов путем многократного упаривания последних с последукяцей кристаллизацией и перекристаллизацией.. Недостатком этого способа является то, что Он позволяет в основном отделить L-триптофай от других аминокислот, что ограничивает его возможности при выделении L-т.риптофана из растворов, содержащих значительные количества иных примесей, например, минеральных солей, окрашенных соединений. Как и в qnoco6e 2 сорбционная емкость ионитов используется неэффективно, контакт сорбентов с растворакш, содержащими в больших количествах oKpiaiaeHHtie и другие примеси, приводит к необратимой потере обменной емкости сорбентов и ухудшению их работы от цикла к циклу, : затрудняет злюирование L-триптофана сорбентов. Для получения рысокочистого продукта применяют такие трудоемкиеи энергоемкие операции как многократное упаривание, крйсталлизацию и перекристаллизацию. Выход Цгтриптофана i около 50% недостаточно велик. Указанные недостатки затрудняют использование этого способа в промышленности.

Целью изобретения является разра. ботка более эффективного и технологичного способа выделения 1-трйптофана из растворов, содержащих большое количество минеральных и органических примесей, который позволил бы получать 1-три-пт.офан в промышленных условиях с высокой чистотой и с высоким выходом.

Поставленная цель достигается тем что сорбцию L-триптофана осуществляю на макропористом слабоосновном анионите, а после десорбции с анионита из полученного элюата L-триптофан повторно сорбируют на сульфокатионите в Н-форме с последующей десорбцией L-триптофана с катионита.

При этом для десорбции L-триптофана с анионита используют обессоленную воду rf/или раствора минеральных кислот в концентрации 0,1-0,5 М при температуре 10,-25°С. Для десорбции триптофана с катионита применяют 1,5-3,0% раствор аммиака в водном растворе этанола при температуре 407о.с.: -; -V- -:-

Согласно предлагаемому способу кристаллизацию триптофана из аммиачйо-спиртбвых элюатов целесообразно осуществлять путем подкисления по следних уксусной кислотой до рН 3,54,0 с последующим охлаждением до 0.joc, «, ., :

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. . . ,

Содержащую L-триптофан культуральиуюягидкость пропускают через колонку с макропористым сорбентом (например, ИА-1р). При этом L-триптофан сорбируется,тогда как мийёралбйыё соли, другие аминокислоты инеионогенные компоненты питательной ерёда неароматического характера практически не поглощаются смолой. Во избежание заиливания сорбента и седиментации микробных клеток в колонне растворв колонку подают в направлении снизу вверх. С другой стороны, такой способ подачи раствора сутцественно улучшает динамику сорбции L-триптофана и исключает слеживание смолы. Диапазон оптимальных значений рН подаваемого раствора от 1,0 до 7,0.

По окончании сорбции колонка с сорбентом промываетсяводой.

В случае наличия окрашенных примесей в исходном растворе элюцию L-триптофана следует прр;водить водой йри комнатной температуре с одновременно подачей триптофансодержащего элюата

колонку с. сульфокатионитом (КУ-2-8, дауэкс 50W) в Н-форме. При десорбции с анионита раствор пропускают через колонку сверху вниз, а при сорбции на сульфокатиопитё снизу вверх. Благодаря отсутствию минеральных солей и целбго ряда других примесей сульфокатиониты поглощают триптофан с выссэкой эффективностью. Одновременно с концентрированием происходит дальнейшая очистка триптофана от окрашенных примесей. Для повышения чистоты конечного продукта осуществляют, промывку катионита в колонне горячей водой при температуре 50-90 С.

Элюцию триптофана с катионита проводят 1,5-3,0% раствором аммиака в водном растворе этанола при 50-70с. Этрт способ элюирования позволяет избежать кристаллизации десорбированного триптофана в колонке и осущест.вить ее в приемнике фракций элюата, не прибегая .к многократному упариванию элюата. Во фракциях с содержанием триптофана более 10 г/л при

охлаждении и нейтрализации в уксусной кислоте Происходит кристаллизация L-триптофана. Выпавшие кристаллы, содержащие L-триптофан, уксусную кислоту и воду, отфильтровывают, промывают этанолом и высушивают в вакууме при температуре порядка 50 С,

Уже на этом этаПе способ позволя.ёт получать продукт с содержанием

основного вещества порядка 99% и выходом около 50%.

Кристаллк1ческий продукт может быть подвергнут дополнительной очистке известным методом, включающим обработку активированным углем и перекристаллизацию из водноэтанольных растворов. .

Фракции аммиачного элюата могут быть обработаны известными методами, включающими упаривание, кристаллизаЦик и пёршгрйсталлизацию или возвращены на стадию сорбции на анионите последуюй1егО технологического цикла. Таким образом, общий выход кристаллич ского L-триптофана может быть :

увеличен до 60-70%.

По предлагаемому способу L-триптофан получает со следующими характеристиками: выход кристаллического L-триптофана 50-70%, содержание основного вещества не менее 99%, удельHde оптическое вращение +30-31 , Н jO), влажность не. более 1,0%, золь-, ность (сульфатная) не более 0,1%, содержание примесей: сульфаты не более 0,01%, хлориды не более 0,01%,

железо не более 0,001%, тяжелые ме- таллы не более 0,001%. Продукт не содержит примесей других аминокислот, йетоксичен и непирогейен.

Способ поясняется следукяцими при-,.

мерами. . Пример 1, 2л раствора, со-;. держащего 16 г L-триптофана, 8,4 г L-аланина, 5,6 г глицина, 7,0 г валина, 10 г дизинхлоргидрата и 4 г L-глутаминовой кислоты, подают на :колон.ну с ИА-1р (объем смолы 0,45 л) в .направлении снизу вверх со.скоростью 0,5 л/час. После обнаружения L-триптофана в фильтрате (пропущено 1,85 л) фильтрат подают на вторую колонну с ИА-1р (объем смолы 0,1 л). Колонны промывают 0,85 л воды (до обнаружения L-триптофана на выходе из второй колонны), после чего проводят десорбцию 0,2 н НСС с обеих . колонн, пропуская раствор в направле нии сверху вниз со скоростью 0,35 л/час. Одновременно элюат подаю на колонну с КУ-2 в Н-форме (объем смолы 110 мл) в направлении снизу вверх. Элюцию кислотой прекращают после прохождения 7 л раствора. Элюцию L-триптофана с КУ-2 проводят 2,0% раствором а лмиака в 50% растворе этанола при температуре 63°С, подавая раствор сверху вниз со скоростью 80 мл/час. Первую фракцию объемом 90 мл отбрасывают. Вторую фракцию объемом 250 мл, содержащую L-триптофан в концентрации более 7,0 г/л, обрабатывают 20 мл ледяной уксусной кислоты до рН 4,5 и охлаждают в течение 20 час при температуре 3-5с. Выпавшие кристаллы отфильт ровывают, промывают охлажденным этанолом и высушивают при 40°С. . В ьезультате получают 11,9 г крис таллического L-триптофана с содержанием основного вещества более 99%. Пример 2. Исходным материалом для выделения L-триптофана является ферментационная среда, полученная в результате культивирования штампа Вас. subtiEis ВНИИгенет;ика 3557 на питательной среде, содержащей сахар, кукурузный экстракт, мо чевину, соли фосфорнокислого калия, сернокислый магний, хлористый натрий Концентрация L-тpиптoфa:нa 6,2.0 г/л. 1 литр культуральной жидкости подают на колонну со смолой ИА-1р объемом 0,25 л снизу вверх со скоростью 0,3 л/час. Затем колонну промывают 0,5 л воды в том же направлении с той же скоростью. После пропускания первых 0,2 л воды и обнаружения в выходящем растворе триптофана в следовых концентрациях выходящий раствор направляют на вторую колонну со . смолой ИА-1р (объем смолы 250 мл). Десорбцию L-триптофана с первой клонны осуществляют 3,0 л воды, по.даваемой со скоростью 0,2 л/час в найравлении сверху вниз.. Элюатj содержащий триптофан, пропускают с то же скоростью через .KOJjoHHy с 80 мл сульфокатионита КУ-2-8 в Н-форме в направлении снизу вверх. Затем крnoHHy со смолой КУ-2-8 промывают d,S л воды при температуре со скоростью О,2 л/час. Элюирование триптофана со смолы КУ-2-8 проводят 0,5 л 1,5% раствора аммиака в 50% водном растворе этано-ла при температуре 58с. Элюат собирают по фракциям, Первая фракция объемов 100 мл содержит триптофан в концентрации 0,15 г/л. Эту фракцию :направляют на стадию сорбции на смоле ИА-1р в последукяцем цикле. Вторая фракция объемом 70 мл содержит триптофан в концентрации 48 г/л. Эту фракцию обрабатывают 5,0 мл ледяной уксусной кислоты до рН 4,10 и охлаждают до . Выпавшие кристаллы отделяют фильтрованием, промывают этанолом и высушивают в вакууме. В результате получается 3,02 г кристаллического триптофана, хромато.графически чистого с содержанием основного вещества 99%. L-триптофана в кристаллическом продукте составляет 48,4%. Содержание триптофана в маточном растворе составляет 5,2 г/л, объем маточного раствора 65 мл, а вместе с промывными водами 80 мл. Этот раствор после отгонки спирта подают на стадию сорбции на смоле ИА-1р в последующем цикле. Третья фракция элюата объемом 350 мл содержит триптофан в концентрации 4,2 г/л. Эту фракцию упаривают в вакууме до объема 18 мл и охлаждают при . Выпавшие кристаллы триптофана отделяют фильтрованием, промывают этанолом и высушивают, в результате получают 1,15 г триптофана с содержанием основного вещества 95%. Общий выход триптофана в кристаллическом продукте составляет 66%. Маточный раствор после крирталлизации триптофана из третьей фракции элюата возвращают на стадию сорбции на смоле ИА-1 в последующих циклах. Пример 3. Культуральная жидкость та же, что в примере 1. Объем культуральной жидкости 2,6 литра. Объем анионита ИА-1р составляет 0,5 л. Условия сорбции и десорбции триптофана в случае смолы ИА-1р аналогичны условиям примера 1 за исключением того, что промывку колонны-после сорбции производят 1,0 литром воды, а ЭЛЮЦИЮ триптофана с .анионита 6,О литрами воды. Элюат, содержащий триптофан, минуя промежуточную емкость, подают на колонну с сулькатионитом Дауэкс 50Wx4 20/50 mesh в Н-форме, взятьм в объеме 70 мл снизу вверх со скоростью 0,2 л/час. По окончании сорбции триптофана колонну с сульфокатионитом промывают 0,5л воды при температуре в направлении снизу вверх со скоростью 0,2 л/час. Элюирование триптофана со смолы .Дауэкс 50Wx4 проводят О,5 л 1,7%

749889 IpactBOpa ал1миака в 50% вбдйомрйство ре этанола при. температуре . Пер вую фракцию объемом. 70 мл, содержащую триптофан в концентрации 0,20 г/ .направляют на стадию сорбции на анио ните ИА-1р в доследующем цикле. Вторую фракцию элюата с сульфодсатионита .объемом 90 мл,содержащую триптофан в концентрации 80,5 г/л, обрабатывают 5,5 мл ледяной уксусной кислоты до рН 4,15и охлаждают до . Выпав ::ше кристаллы обрабатывают так же, как в примере 1. В результате получают 6,55 г крйсталлическсзго L-триптрфана, хроматрграфическй чистого, с содержанием основного вещества 99% Выход L-триптофана в кристаллическом продукте составляет 51,2%. Маточный раствор объемом 78 мл ссбдёржанИем триптофана 5,1 г/л и промывные воды после отгонки спирта возвращают на стадию сорбции на анионите ИА-1 в по следующем цикле.. Третью фракцию элюата объемом 315 мл .с содержанием триптофана в концентраций 6,5 .г/л упаривают до объема 30 мл и охлаждают при . Вьатвшие кристаллы отделяют фильтрованием, промывают этанолом и высушивают. В результате получается 1,98 г кристаллического триптофана с содёржанк е основного вещества 96% Общий выход триптофана в кристаллическом продукте составляет 67,2%. Кристаллы триптофана с сбдержаЩемоснрвнЬгЬ вещества 96% перекристалл из овывают. Для этого 2,25 г триптофана растворяют в 25 мл 50% этанола при нагревании. В раствор добавлШт 0,4 г активированного угля, горячий раствор фильтруют, фильтрат охлажд.ают и выпавшие кристаллы триптофана отфильтровывают, промываюТ этанолом и высушивают. В результате получаю т 1,56 г триптофана, хроматографически чистого, с содержанием основного вещества 99%. Выход на стадий перекристаллизации составляет 72%

8 в пересчете на триптофан с содержанием основного вещества 100%; Формула изобретения 1.Способ вьщеления L-триптофана из растворов путем сорбции его на ионообменных смолах, д есорбции полученного элюата и кристаллизации, отличающийся те.м, что, с целью повышения эффективности процеоса, а также получения готового продукта, свободного от примесей, сорбцию L-триптофана осуществляют на макропористой слабросновном аниониТе, а после десорбции с анионита из полученного элюата L-триптофан повтppнo сорбируют на сульфокатионите в Н-формё с последующей десорбцией L-триптофана с катйонита. 2.Способ по п. 1, отличающ с я тем, что десорбцию L-триптофана с анионита осуществляют обессоленной водой и/или растворами минеральных кислот в концентрации 0,10,5 М при температуре 10-25°. 3.Спрсоб по п. 1, бтличающ и и с я тем, что десорбцию L-триптофана с катйонита осуществляют 1,53,0% раствором аммиака в водном растворе этанола при температуре 40-70°С. 4.Способ по п. 1, отличающийся тем, что кристаллизацию L-триптофана из аммиачнр-спиртрвых элюатов проводят путем подкисления последних уксусной кислотой до рН 3,5-4,О с последующим охлаждением до 0-5°С. . Источники информации, принятые вр внимание при экспертизе 1.Патент США 2.416.956, опублик. 1947. 2.Патент .США №.2.700.672, опублик. 1955. 3. Патент США № 3,450.712/ опублик. 1969 (прртртип).