СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРИСТАЛЛИЧЕСКОГО ТИЛОЗИНА Российский патент 1998 года по МПК C12P17/00 C12P17/08 C12P1/06 C07H17/08 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения тилозина, макролидного антибиотика широкого спектра действия, находящего применение в сельском хозяйстве.

Для профилактики заболеваний и лечения сельскохозяйственных животных и птицы тилозин используют перорально (в виде кормовых препаратов, содержащих тилозин-сырец низкой степени очистки) или парентерально (в виде препаратов тилозина основания и его водорастворимых солей, содержащих не менее 80% тилозина A).

Простейший способ для получения пероральных препаратов состоит в выращивании культуры-продуцента на подходящей питательной среде в оптимальных условиях и в последующем высушивании культуральной жидкости, в результате чего получают кормовой продукт, содержащий от 2 до 5% антибиотиков тилозиновой группы, остатки питательной среды и мицелий продуцента [1]. Способ позволяет получать препарат тилозина, называемый "Фрадизином" с низким содержанием активного начала и обладающий высокой гигроскопичностью.

Простое отделение мицелиальной массы фильтрованием для культуральных жидкостей с активностью 4000 мкг/мл и выше позволяет повысить концентрацию тилозинов в сухом препарате в 2 раза и получать таким образом препараты тилозина-фосфата 10%, которые хорошо растворяются в воде и согласно НТД сохраняют свои свойства в течение двух лет [2].

Для получения более очищенных препаратов тилозина необходимо использовать специальные методы очистки, например экстракционные.

Описан способ получения тилозина, предусматривающий выращивание культуры продуцента, отделение мицелия, экстракцию целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости бутилацетатом, реэкстакцию антибиотика из органической фазы подкисленной водой, повторную экстракцию водной фазы бутилацетатом после подщелачивания, обработку экстракта активированным углем и осаждение целевого продукта в виде основания [3].

Этот способ, хотя и позволяет получать тилозин высокой степени чистоты (до 90%), но характеризуется многостадийностью, значительными потерями целевого продукта (до 50%) и образованием значительных объемов производственных отходов.

Имеются варианты технологий, которые основаны на сочетании экстракционных и сорбционных методов очистки.

Так, запатентован способ получения тилозина, заключающийся в том, что культуру-продуцент выращивают в питательной среде, отделяют мицелий, фильтрат культуральной жидкости экстрагируют органическим растворителем (хлороформом, бензолом) из органического экстракта тилозин сорбируют на таких сорбентах, как активированный уголь, гель гидроксида алюминия, или на таких ионообменных смолах, как XE 64, IRC 50 (слабокислотные катионообменные смолы), дауэкс 50 (сильнокислотная катинообменная смола), или на сорбентах на основе карбоксиметилцеллюлозы. Целевой продукт в виде тилозина-основания элюируют низшими спиртами или низшими спиртами, содержащими до 50% низшего кетона, и получают тилозин 70...80%-ной степени чистоты [4].

В дальнейшем были предложены сорбционные способы выделения тилозинов из водной фазы.

Известен способ получения тилозина, состоящий из этапов выращивания культуры-продуцента в подходящих условиях, отделения мицелия, доведения pH фильтрата до значений 7,5...10,0, сорбции целевого продукта на неионогенной полимерной смоле типа ER-180, амберлит, дуолит и его элюции водно-спиртовыми или водно-ацетоновыми растворами. Раствор тилозина основания обесцвечивают затем на макропористой смоле и осаждают высаливанием хлоридом натрия. Для получения водорастворимых тартрата или фосфата тилозина к раствору тилозина основания добавляют эквимолярное количество соответствующей кислоты и раствор высушивают [5].

Недостатком этого способа является использование органических растворителей.

Наиболее близким по технической сущности следует признать способ получения тилозина, заключающийся в том, что культуру-продуцента выращивают в оптимальных условиях, отделяют мицелий, обессоливают фильтрат культуральной жидкости электродиализом, сорбируют целевой продукт на катионите средней кислотности типа КРФ-2 или КБ-2Э в натрий водородной форме, элюируют тилозин 1-2 н. раствором динатрийфосфата с pH 9,0...9,5, выдерживают раствор при повышенной температуре при pH 9,5 и перемешивании, впавшие кристаллы тилозина основания промывают и высушивают [6].

Недостатком прототипа является трудоемкость предложенных авторами вариантов обессоливания фильтрата культуральной жидкости либо многочасовыми операциями электродиализа, либо многократным пропусканием фильтрата сперва через колонны с анионитом типа ЭДЕ-10п в гидроксильной форме или типа АВ-17 в гидроксильной форме, а затем через колонны с катионитом КУ 2х20 в H⁺-форме. Определяя концентрацию тилозина с помощью УФ-спектроскопии, авторы не могли видеть, что их выводы о чистоте продукта относятся уже не к тилозину А, а к продуктам его развала. По этой причине указанная в примере чистота 97% для препарата тилозина является завышенной. Экспериментально нами было показано, что достаточно одного пропуска фильтрата культуральной жидкости в рекомендованных авторами условиях, чтобы относительное содержание тилозина А упало с 80...85% в исходном культуральном фильтрате до 50...60% в обессоленном растворе. На необоснованность этого этапа указывает и то, что уже следующий предусматривает элюцию тилозинов 1...2 н. фосфатными буферами, чтобы получить продукт, содержащий 9...10% тилозиновых антибиотиков на сухой вес, т. е. тот самый продукт, который получают высушиванием культурального фильтрата, с той лишь разницей, что, по-видимому, более полезные метаболиты культуральной жидкости заменены в нем солями фосфорной кислоты. По причине многокомпонентности тилозинового комплекса в конечном элюате и его низкой концентрации затруднено также выпадение тилозинов при подщелачивании и перемешивании.

Целью настоящего изобретения является разработка высокоэффективной, технологичной схемы очистки антибиотиков тилозинового комплекса, которая несмотря на высокую лабильность тилозинов позволяет сохранить компонентный состав, полученный на стадии биосинтеза, получить продукт с высоким выходом.

Эта цель достигается тем, что на стадии обработки культуральной жидкости подкисление фосфорной кислотой проводят при комнатной температуре и через короткий промежуток времени (15...30 мин) оттитровывают 20%-ным раствором гидроксида кальция.

В отличие от общепринятых схем очистки высокопродуктивных культуральных жидкостей, в которых антибиотик является основным продуктом культурального фильтрата, а остальные метаболиты и неиспользованные компоненты питательной среды присутствуют в растворе в незначительных количествах, которые направлены на удаление этих примесей и по которому шли авторы прототипа, мы выбрали путь избирательного выделения и концентрирования антибиотиков тилозиновой группы.

Действительно оказалось возможным сорбировать антибиотики тилозинового комплекса из фильтратов культуральной жидкости на карбоксильные катиониты типа КБ-2Э, ДК-115. При этом динамическая емкость катоинита КБ-2Э имеет величину от 50 до 100 на 1 л катионита в H⁺-форме. Для смолы ДК-115 она составляет величину от 20 до 30 г/л.

После промывки дистиллированной водой тилозины легко элюируются с колонны разбавленными растворами аммиака от 0,25 до 1 н. Предпочтение имеет концентрация 0,5 н. С отработанными элюатами через колонну проходит до 90% примесей от сухого веса. Аммиачные элюаты тилозиновых антибиотиков концентрируются в вакууме для практически полного удаления аммиака (в 6-10 раз), тилозины в концентрате оттитровываются эквимолярными количествами соответствующих кислот (фосфорная, винная) и упариваются насухо. При этом удельная активность по сухому весу повышается со 100...150 мкг/мг для фильтрата культуральной жидкости до 550...700 мкг/мг для фосфата тилозина.

Дополнительная очистка тилозина осуществляется известными методами путем кристаллизации и осаждения из водных растворов при температуре 30...35^oC и при pH 9,0...9,5.

В сравнительных примерах было показано, что антибиотик не сорбируется на катионит КБ-2Э в NH+4

Таким образом, для фильтратов культуральной жидкости с суммарной концентрацией тилозинов от 4 до 8 г/л их полная сорбция может быть осуществлена на 20...25% объемах смолы КБ-2Э в H⁺-форме от объема культуральной жидкости.

Поскольку в отличие от прототипа предложенный способ использует в процессе вместо трех типов смол одну, то расход воды и реактивов для регенерации и промывки смолы уменьшается как минимум в 3 раза.

Сущность предложенного способа иллюстрируется приведенными ниже примерами.

Пример 1. Культуру штамма Str. fradiae, продуцирующего тилозин, высевают в ферментер емкостью 5 л на среду, содержащую (в мас.%) муку пшеничную 1,5; глутен кукурузный 1,0; мелассу свекловичную 2,5; дрожжи сухие 0,25; однозамещенный фосфат аммония 0,2; масло соевое 3,0; мел 0,2; воду водопроводную до 100,0.

Процесс культивирования проводили при температуре 29^oC, при перемешивании 220 об/мин и аэрации 1,5 объема воздуха на 1 объем среды в мин. Через 7 сут процесс заканчивают. Получают 3 л культуральной жидкости с суммарной концентрацией тилозина 3500 мкг/мл и относительным содержанием тилозина A 85%.

Культуральную жидкость после ферментации сливают в эмалированную кастрюлю на 5 л и при интенсивном перемешивании приливают раствор 56%-ной фосфорной кислоты до величины pH 4,5...5,0, затем при интенсивном перемешивании приливают 20%-ный раствор суспензии гашеной извести до величины pH 7,5... 8,0. Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре еще 1 ч для завершения процесса коагуляции и фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Получают 454 г (≈ 15%) влажной биомассы с суммарной концентрацией тилозиновых антибиотиков 2000 мкг/г (всего ≈ 1 г) и 2,55 л культурального фильтрата с концентрацией тилозиновых антибиотиков 3700 мкг/мл (всего 9,45 г). С учетом потерь антибиотика в мицелиальной массе выход тилозина составил 90%.

Пример 2. Через колонну диаметром 2,5см и высотой 50 см, заполненную 60 мл смолы КБ-2Э-2 в H⁺-форме, с помощью перистальтического насоса в направлении снизу-вверх прокачивают 1100 мл фильтрата культуральной жидкости, полученного в условиях примера 1, имеющего pH 7,9 и суммарную концентрацию антибиотиков тилозинов 5475 мкг/мл. Относительное содержание тилозина A от суммы антибиотиков 73%, общее количество тилозина A в фильтрате 4,43 г.

После появления тилозина A в элюате колонну промывают в направлении сверху-вниз 1410 мл дистиллированной воды. Элюаты с колонки собирают с помощью коллектора фракций в пробирки, объем фракции 30 мл. Качественный и количественный контроль за процессом ведут с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках силикагель G-60 фирмы Мерк в системе растворителей этилацетат-диэтиламин (95:5). Количественное определение проведено на сканирующем денситометре КМ-3 фирмы Opton по стандарту тилозина A при длине волны 283 нм.

Проскок тилозина в процессе сорбции и промывки водой установлен в общем объеме 380 мл, суммарная концентрация тилозинов в проскоке 1035 мкг/мл, относительное содержание тилозина A 58%, общее количество тилозина A в проскоке 0,186 г. На колонке сорбировалось 5,77 г суммы тилозинов, из них 4,24 г тилозина A.

Элюцию тилозинов с колонны проводят в направлении снизу-вверх 0,25 н. водным раствором аммиака. Объем элюата 760 мл, суммарная концентрация тилозинов 3771 мкг/мл. Всего с колонки элюировано 2,87 г тилозинов, в которых содержится 83% - 2,38 г тилозина A. Выход после элюции по тилозину A составил 54% от сорбированного на колонну количества тилозина A.

Полученный с колонны элюат, содержащий тилозины, концентрируют в вакууме до 300 мл (pH 8,4) и остаток подкисляют 56%-ной фосфорной кислотой до pH 5,65 (всего 0,7 мл кислоты); затем смесь упаривают насухо. Получают 6,86 г сухого препарата с суммарной активностью антибиотиков тилозинов 540 мкг/мг или 3,71 г тилозинов, из них 1,86 г (51% относительный) тилозина A. Выход по сумме тилозинов 65% (по тилозину A 44%).

Пример 3. Через хроматографическую колонну со смолой КБ-2Э-2 (pH промывной воды 2,9), параметры которой указаны в примере 2, со скоростью 2,6 мл/мин, в направлении снизу-вверх пропускают фильтрат культуральной жидкости, полученный по примеру 1. Объем фильтрата 1168 мл, суммарная концентрация антибиотиков тилозинов 4833 мкг/мл, относительное содержание тилозина A 67%. Всего в фильтрате содержится 3,77 г тилозина A. После подачи фильтрата на колонку ее промывают 500 мл дистиллированной воды в направлении сверху вниз. Проскок тилозинов в процессе сорбции и элюции составил 1450 мл с суммарной концентрацией тилозинов 1400 мкг/мл, всего 2,03 г (1,543 г тилозина A).

На смоле сорбировалось 3,60 г тилозинов. Элюцию проводят в направлении снизу-вверх со скоростью 2,6 мл/мин 0,5 н. водным раствором аммиака. Общий объем элюата, содержащего тилозины, 345 мл, суммарная концентрация антибиотиков тилозинового комплекса 4167 мкг/мл (относительное содержание тилозина A 60%).

Элюат концентрируют в вакууме до 30 мл (pH 8,0), подкисляют 56%-ной фосфорной кислотой до pH 6,0 и упаривают насухо. Получают 4,2 г сухого остатка с суммарной активностью тилозинов 428 мкг/мг. Относительное содержание тилозина A 54%. Выход 49,3%.

Пример 4. Через хроматографическую колонну, заполненную смолой КБ-2Э-2 в H⁺-форме с pH промывной воды 3,25, параметры которой указаны в примере 2, в направлении снизу вверх со скоростью 2,6 мл/мин пропускают 584 мл фильтрата с pH 7,9, с суммарной концентрацией тилозинов 2955 мкг/мл и относительным содержанием тилозина A 89%, полученного в условиях примера 1.

После сорбции колонну промывают 500 мл дистиллированной воды. Тилозины обнаружены в общем объеме 150 мл, суммарная концентрация тилозинов 141 мкг/мл, относительное содержание тилозина A в смеси 70%. На смолу сорбировалось 1,71 г тилозинов, в том числе 1,52 г тилозина A.

Элюируют тилозины в направлении снизу вверх 1 н. водным раствором аммиака со скоростью 2,6 мл/мин. Объем элюата (610 мл) концентрируют в вакууме до 100 мл (pH 9,4), подкисляют 56%-ной фосфорной кислотой до pH 6,0 (≈ 0,31 мл) и упаривают насухо. Получают 3,24 г сухого остатка с активностью 371 мкг/мг и относительным содержанием тилозина A 84%. Выход составил 70%.

Пример 5. Через колонну, заполненную 60 мл смолы КБ-2Э-2 в H⁺-форме с pH промывной воды 4,2, с параметрами, указанными в примере 2, пропускают 380 мл фильтрата культуральной жидкости (pH 8,75), полученного в условиях примера 1. Суммарная концентрация тилозинов в фильтрате 5036 мкг/мл, относительное содержание тилозина A 89%. Остальная обработка проводилась по примеру 3. На смоле сорбировалось 1,91 г тилозинов. Антибиотики элюируют 0,5 н. водным раствором аммиака со скоростью 2,6 мл/мин в направлении снизу-вверх. Объем элюата 410, мл, суммарная концентрация тилозинов 4384 мкг/мл, относительное содержание тилозина A 88%. Элюат концентрируют в вакууме до 100 мл (pH 8,15), подкисляют 20%-ным водным раствором винной кислоты до pH 5,5 и упаривают насухо. Получают 2,2 г сухого препарата с суммарной активностью тилозинов 653 мкг/мг и относительным содержанием тилозина A 84%. Выход 76%.

Пример 6. Через колонну с параметрами, указанными в примере 2, пропускают 680 мл фильтрата культуральной жидкости, имеющего величину pH 7,7, полученного в условиях примера 1. Суммарная концентрация тилозинов 5747 мкг/мл, относительное содержание тилозина A 85%. По окончании подачи фильтрата с той же скоростью и в том же направлении промывают 600 мл дистиллированной воды. На смоле сорбировалось 3,91 г тилозинов. Элюцию тилозинов проводили в направлении снизу-вверх 1 н. фосфатным буфером с pH 9,0. Объем элюата 330 мл, суммарная концентрация тилозинов 7188 мкг/мл, всего снято 2,37 г тилозинов с относительным содержанием тилозина A 69%. Сухой остаток весом 25,7 г имеет суммарную активность тилозинов 92 мкг/мг.

Пример 7. Через колонну с параметрами, указанными в примере 2, заполненную 207 мл смолы КБ-2Э-2 в натрий-водородной форме [6], в направлении сверху-вниз пропускают 100 мл фильтрата с суммарной концентрацией тилозинов 7950 мкг/мл и относительным содержанием тилозина A 82%. По окончании подачи фильтрата колонну промывали 200 мл дистиллированной воды. Проскок тилозина обнаружен в 100 мл фильтрата с суммарной концентрацией тилозинов 4907 мкг/мл; всего 0,4907 г, содержание тилозина A 88%. На смоле сорбировалось 0,3041 г тилозинов. Элюцию тилозинов проводят в направлении снизу-вверх со скоростью 2,6 мл/мин 1 н. Na₂HPO₄ раствором с pH 9,5. Объем элюата 200 мл, общее содержание тилозинов 0,207 г, содержание Na₂HPO₄ 14,0 г. Активность тилозинов на сухой вес имеет величину 14...15 мкг/мг. Выход 68,1%.

Пример 8. Через колонну с параметрами, указанными в примере 2, заполненную 60 мл смолы DK-115 в H⁺-форме, отмытой дистиллированной водой до pH 3,0, пропускают в направлении снизу вверх 750 мл фильтрата с pH 6,9, с суммарной концентрацией тилозинов 5725 мкг/мл и относительным содержанием тилозина A 83%, полученного в условиях примера 1. Затем колонку промывают 500 мл воды. Проскок тилозина установлен в 600 мл, суммарная концентрация тилозинов 3438 мкг/мл, относительное содержание тилозина A 84%. На смоле сорбировалось 2,23 г тилозинов.

Тилозины с колонны элюируют в направлении снизу-вверх 0,25 н. водным раствором аммиака. Объем элюата составил 1512 мл. После концентрирования в 10 раз, подкисления до pH 6,0 56%-ной фосфорной кислотой 471 мкг/кг и относительным содержанием тилозина A 87%. Выход 51,7%.

Пример 9. Через колонну со смолой и параметрами, представленными в примере 8, прокачивают 415 мл фильтрата с pH 6,25, суммарной концентрацией тилозинов 4556 мкг/мл (всего 1,89 г) и относительным содержанием тилозина A 84% (всего 1,64 г), полученного по примеру 1. По окончании подачи фильтрата на колонну в направлении сверху вниз с такой же скоростью подают 500 мл дистиллированной воды. На смоле сорбировалось 1,89 г суммы тилозинов. Тилозины элюируют с колонны в направлении снизу-вверх 1 н. водным раствором аммиака. Объем элюата 2850 мл, концентрация тилозинов 360 мкг/мл. Элюат концентрируют в вакууме в 10 раз, подкисляют 56%-ной фосфорной кислотой до pH 6,0 и упаривают насухо. Получают 3,12 г сухого остатка с активностью 311 мкг/мг и относительным содержанием тилозина A 53%. Выход 51,3%.

Таким образом, по мнению заявителя, наглядно показаны преимущества предложенного способа перед известными способами. Заявителю не известны сорбционные способы очистки тилозиновых антибиотиков, использующие на стадии элюции разбавленные водные растворы аммиака. Осуществимость такой схемы, обеспечивающей более чем 5-кратную очистку тилозинов от сопутствующих примесей с высоким выходом, не представлялась очевидной.

В этой связи заявитель полагает, что предложенный способ очистки тилозиновых антибиотиков соответствует требованиям, предъявляемым к изобретению.

Источники информации
1. Гарбузов А. В., Грешных К.П., Эльбирт Г.М. и др. Препараты антибиотиков и витаминов для животноводства. - М.: ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР, 1991, Вып. 1. - 52 с.

2. Авторское свидетельство НРБ 20.697, кл. C 12 D 9/16, 1978.

3. Патент США 3.178.341, кл. 424-120, 1965.

4. Патент США 4.568.740, кл. C 07 H 17/08, 1986.

5. Авторское свидетельство СССР 1.699.162, кл. C 12 P 17/00, Бл. N 11, 20.04.96.

6. Патент России N 93057173/13 (056964), приоритет от 12.12.93, положительное решение от 31 июля 1995 г. (патент аналог). БИЗ N 9616, 10.06.96.

Изобретение относится к биотехнологии. Разработан способ получения кристаллического тилозина. На первой стадии способа осуществляют выращивание культуры продуцента в оптимальных для него условиях. Затем проводят отделение мицелия от культуральной жидкости и сорбцию тилозиновых антибиотиков на кислотном катионите. Элюцию их с сорбента осуществляют разбавленными растворами водного аммиака с последующим высушиванием целевого продукта, что позволяет получить более чистый тилозин с высоким выходом.

Способ получения кристаллического тилозина, предусматривающий выращивание культуры продуцента в оптимальных условиях, отделение мицелия, сорбцию тилозина на кислотном катионите, его элюцию и высушивание раствора целевого продукта, отличающийся тем, что элюцию тилозиновых антибиотиков с сорбента проводят разбавленными растворами водного аммиака.