Штамм бактерий BacILLUS SUвFILIS, осуществляющий деградацию 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты Советский патент 1992 года по МПК C02F3/34 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения штамма бактерий, осуществляющего микробиологическое раз- оушение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и ее аминной соли (2,4-Д/А), используемых в качестве гербицидов для борьбы с сорняками на посевах хлебных злаков, и может быть использован для очистки сточных вод от 2,4-Д.

Известен штамм бактерий Arthrobacter sp., участвующий в биологической деградации 2,4-D. Известен штамм гриба Asperglllus niger, способный использовать 2,4-Д в качестве единственного источника углерода и энергии.

Недостатком известных штаммов является то, что для них не установлена эффективность деградации 2,4-Д, достигаемая в

результате ее метаболизма в условиях культивирования штаммов в жидких средах. Оцениваемый эффект касается скорости минерализации 2,4-Д и токсичности продуктов деградации.

Цель изобретения - получение штамма бактерий Bacillus subtills BKM В-1742Д (штамм 16), способного осуществлять эффективную биологическую деградацию гербицида 2,4-Д.

Штамм выделен из активного ила БОС (биологических очистных сооружений) производства хлорфенолов методом накопительных культур.

Штамм хранят в лиофилизированном состоянии. Проверка жизнеспособности штамма проводится высевом на мясо-пеп- тонный агар один раз в 12 мес.

Штамм имеет следующую характеристику.

Культу рал ьно-морфологические признаки. Клетки представляют собой грампо- ложительные подвижные палочки диаметром 1 мкм, одиночные и в парах. Споры овальные, расположенные в центре клетки. При росте на мясо-петонном бульоне образует развитую матовую пленку, среда при этом остается прозрачной. При встряхивании биомассы в жидкой среде ее полного диспергирования не происходит. На среде Эшби образует клейстеровидные, конусообразные гладкие колонки с ризоид- ным краем. На ломтиках картофеля рост обилен в виде колоний кремового цвета, гладких, сильно крупноскладчатых.

Физиолого-биохимические признаки. Сбраживает сахарозу, арабинозу, маннозу, маннит, сорбит, использует цитрат и мало- нат натрия, лизин. Не использует лактозу, рамнозу, галактозу, фенилаланин, не активен в отношении мочевины, орнитина, аргинина. Активно гидролизует желатину, причем происходит разжижение всего стол- бика. Активно гидролизует казеин и крахмал. Молоко свертывает и пептонизирует без изменения реакции среды.

Проявляет нитратредуктазную активность. Реакция Фогес-Проскаузра положи- тельная. Клетки каталазоположительны. Не продуцирует свероводород и индол. Леци- тиназная реакция отрицательна.

Не требует присутствия в среде факторов роста: растет на среде с аммонийным и нитратным азотом и сахарозой, а также на среде без специального внесения источника азота. Растет в присутствии 7% NaCI в мясо-пептонном агаре.

Чувствителен к пенициллину, фенокси- метилпенициллину, канамицину, ампициллину, карбенициллину, эритромицину, олеандомицину, линкомицину, ристомици- ну, тетрациклину, стрептомицину, мономи- цину, гентамицину, незамицину, рифамлицину, физидиевой кислоте. Высокочувствителен к хлорамфениколу. Устойчив к полимиксину.

Для штамма характерен аэробный рост за исключением роста в среде с нитратами (жидкая среда Гильтая). Температурный диапазон роста от 20 д 60°С при 10°С рост практически отсутствует, при 55°С рост умеренный; оптимальная температура роста 30-37°С. Рост возможен в области рН от 4 до 9, оптимальный диапазон 7-8. Штамм не патогенен для человека и животных.

Данные по росту штамма в условиях периодической культуры в среде с разными

концентрациями 2.4-Д/А приведены в таблице 1.

Для определения числа клеток пробы, отобранные после 3, 7, 14, 21 и 30 сут культивирования в жидкой среде с добавлением 2,4-Д/А в качестве единственного источника углерода и энергии, разводят в зависимости от плотности клеточной суспензии и аликвоты этих разведенных проб высевают на агаризированную мясо-пептонную среду, разлитую в чашки Петри. Чашки Петри инкубируют в течение 16-18 ч при 30°С и затем подсчитывают количество выросших колоний. Подсчет количества клеток в 1 мл исследуемой суспензии проводят по формуле

М

10 п

V где М - количество клеток в 1 мл;

а - среднее число колоний при высеве данного разведения;

10 - коэффициент разведения;

п - порядковый номер разведения, из которого сделан высев;

V - объем высеваемой суспензии, взятый для посева, мл.

Штамм сохраняет жизнеспособность в диапазоне концентраций 2,4-Д/А до 10 г/л.

На 3-суточных проростках кукурузы проводили тестирование продуктов метаболизма 2,4-Д, накапливаемых в культураль- ной жидкости штамма.

Для этого делают отборы культуральной жидкости через определенные промежутки времени культивирования штамма В. subtilis В-1742Д в следующих условиях. Посевной материал получают выращиванием штамма в пробирках в мясо-пептонном бульоне при 30°С. Полученный посевной материал засевают в количестве 0,01 % от объема в жидкую среду следующего состава: 1 г;-К2НР04 5 г; MgClz 4H20 0,3 мг; MgS04 7H20 50 мг; FeSO 7НзО 5 мг; CuS04 5Н20 1 мг; ZnS04 0,8 мг на 1 л; рН 6,8-7.0. В среду вносят 100 мг 2,4-Д, Культивирование проводят при 30°С.

Культуральную среду освобождают от клеток штамма центрифугированием алик- вот среды при 5 тыс.об. в мин в течение 15 мин. После этого среда готова для тестирования. Проростки кукурузы линии ВИР-38 проращивают в течение 3 сут при 25-26°С. Отбирают проростки, имеющие одинаковую длину центрального корешка. Длина корешка должна составлять 3,0+0,2 см. Проростки помещают в чашки Петри по 10 шт. в каждую. Предварительно на дно чашки Петри помещают фильтровальную бумагу и наливают в каждую чашку по 10 мл подготовленной для тестирования культуральной среды, разбавленной в 10 раз. Чашки с проростками инкубируют при 25-26°С в течение 3 сут и после этого замеряют длину центрального корешка каждого проростка и опреде- ляют среднее значение для каждого варианта опыта. Контролем является среднее значение длины центрального корешка кукурузы, инкубированной с водой.

Определяют среднее значение увеличе- ния длины центрального корешка проростков кукурузы для каждого опыта и подсчитывают процентное отношение увеличения средней длины центрального корешка проростков в опытах с метаболитами к увеличению средней длины в контроле.

Эта величина обозначается как

In - lo

ЧУ

100%,

1К-1о

где 1П - средняя длина центрального кореш- ка проростка кукурузы для каждого опыта с метаболитами;

IK - средняя длина центрального корешка проростка кукурузы в контроле:

10 - средняя длина центрального кореш- ка проростка кукурузы в начале опыта.

В табл. 2 приведены результаты опытов по оценке токсического эффекта на проростки кукурузы метаболитов 2.4-Д. накапливаемых в процесе культивирования штамма. Средняя длина центрального корешка проростка кукурузы после инкубации на воде без добавления культуральной жидкости принята за 100% и служит контролем.

Условия тестирования (разведение проб культуральной жидкости-, фаза развития проростков) подобраны так, чтобы для проб культуральной среды, отобранных до начала культивирования штамма, рост корешков составлял 50% от контроля.

Из табл. 2 видно, что культуральная жидкость, отобранная после 3 сут культивирования штамма, оказывает тормозящее действие на рост корешков кукурузы и увеличение центрального корешка в данном опыте составляет 55,6% от контроля. Далее, с уменьшением количества 2.4-Д на 7-е сутки культивирования штамма тормозящее действие культуральной жидкости уменьшается и средняя длина центрального ко- решка составляет 71.8% от контроля. С уменьшением количества 2.4-Д на 11-е сутки культивирования эффект торможения роста корешков снижается и увеличение средней длины центрального корешка со-. ставляет 85,9% от контроля

Таким образом, ингибирующий эффект действия 2,4-Д, оцениваемый в начале опыта в 50%, снижается с уменьшением количества гербицида в процессе культивирования штамма, а накапливаемые продукты метаболизма не оказывают токсического действия на проростки кукурузы.

Анализировали содержание 2,4-Д в культуральной жидкости в процессе роста штамма. Условия культивирования описаны, среда содержит 100 мг/л 2,4-Д.

Анализ содержания 2,4-Д проводят методом газо-жидкостной хроматографии. Для анализа отбирают по 1Q мл культуральной жидкости через определенные промежутки времени. Клетки удаляют из среды центрифугированием при 5 тыс.об. в мин в течение 15 мин, жидкость подкисляют добавлением нескольких капель соляной кислоты и про- водят 3-кратную экстракцию 2,4-Д равными объемами хлороформа, После экстракции хлороформ удаляют отгонкой на вакуумном роторном испарителе, метилируют и фракционируют на хроматографе ЛХМ-8Д с ионизационно-резонансным детектором.

Условия определения:-стеклянные спиральные колонки 110x0,3 см с 3% ov-225 или 5% ov-1 на инертоне супер (0,16-0,20 мм), температура испарителя 210°С. детектора 190°С, колонки 160°С, расход гелия 60 мл/мин.

В результате анализов установлено, что на 7-9-е сутки культивирования штамма остаточное количество 2,4-Д составляет около 50%, на 10-14-е сутки культивирования - около 20%.

Пример. Используют сточную воду производства гербицида 2,4-Д после обес- феноливания со стадии хлорирования фе- нолсодержащих вод из сборника. В такой воде, которая направляется непосредственно на БОС, содержание хлорфенолов составляет в среднем 30 мг/л/

В одну из колб объемом 250 мм вносят 100 мл сточный воды, в другую - 100 мл сточной воды и следующие соли, г/л:

KN032,0

КН2Р040,3

N32HP040.3

NaH2P04 02Н200,7

MgS(V7H200,4

рН доводят до 7,0-7,2 добавлением 5%-ного раствора. Колбу засевают 3% по объему посевным материалом 107 кл/мл, выращивание проводят на качалке (220 об./мин) при 30°С

Количество хлорфенолов определяют в процессе культивирования на спектрофто- метре при длине волны 273-279 нм после их экстракции из проб в CCI4 (табл. 3).

Как видно из приведенных данных, штамм активен в реальных стоках производства гербицида. Степень биологической очистки после 2 сут культивирования составляет: в сточной воде более 33%, в сточной вода с добавлением питательных солей

90%.

Полученные данные свидетельствуют о том, что штамм В. subtills BKM В-1742Д способен активно метаболизировать герби- 2,4-Д, при этом продукты метаболизма.

накапливаемые в среде, проростков растений.

нетоксичны для

Формула изобретения Штамм бактерий Bacillus subtills BKM В-1742Д, осуществляющий деградацию 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения штамма бактерий, осуществляющего микробиологическое разрушение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и ее аминной соли, используемых в качестве гербицидов для борьбы с сорняками на посевах хлебных злаков. Штамм может быть использован для очистки сточных вод.от 2,4-Д. Целью изобретения является получение штамма бактерий Bacillus subtilis AKM В-1742Д (шт. 16); способного осуществлять эффективную биологическую деградацию гербицида 2,4-Д. Штамм способен почти Ясут культивирования на сточных водах производства гербицида разгружать до 90% хлорфенолов в среде при их исходной концентрации 30 мг/л; при этом продукты метаболизма, накапливаемые в среде, нетоксичны для проростков растений. 3 табл. СО с

Определение числа клеток проводили чашечным методом Коха.

Таблица 2

Таблица 3