ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ БИОДЕГРАДАЦИЮ 2,4-ДИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК Р МК 16, СОДЕРЖАЩАЯ ГЕНЫ БИОДЕГРАДАЦИИ 2,4-ДИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК Р МК 16, СОДЕРЖАЩЕЙ ГЕНЫ БИОДЕГРАДАЦИИ 2,4-ДИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1996 года по МПК C12N15/30 C12N1/21 C02F3/34 B09C1/10 

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии и представляет собой рекомбинантный штамм E.coli НВ 101рМК16, несущий рекомбинантную плазмиду рМК16, определяющую процесс биодеградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), используемой в качестве гербицида в сельском хозяйстве. Изобретение можно использовать при разработке эффективного способа биологической защиты окружающей среды.

Известен ряд штаммов, осуществляющий биологическую деградацию 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Это штаммы: Aspergillus niger, Pseudomonas sp. Arthrobacter sp. Bacillus subtilis, Streptomyces viridochromogenes, Flavobacterium peregrinum, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes paradoxus.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к заявляемому штамму является штамм Bacillus subtilis В-1742, осуществляющий биологическую деградацию 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты.

Однако штамм, выбранный для прототипа, в сравнении с заявляемым менее эффективно осуществляет деградацию 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Кроме этого, для штамма Bacillus subtilis В-1742 не может быть легко восстановлено свойство деградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты при его элиминации, как это возможно сделать в случае рекомбинантного штамма E.coli HВ 101 рМК 16 методом трансформации рекомбинантной плазмиды рМК 16 в компетентные клетки E.coli HВ 101.

Целью изобретения является конструирование нового рекомбинантного штамма, осуществляющего эффективную биодеградацию 2,4-Д.

Цель достигается трансформацией компетентных клеток E.coli HВ 101 рекомбинантной с плазмидой рМК 16. Способ конструирования плазмиды рMK 16 основан на гидролизе плазмиды вектора pBR 322 и ДНК штампа Bacillus subtilis В-1742 Д эндонуклеазой Bam HI, лигирования полученных фрагментов с последующим клонированием их в E.coli HB 101 и отбором рекомбинантных клонов, содержащих экспрессирующиеся гены деградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты.

Пример 1. Получение векторных молекул pBR 322.

Векторные молекулы pBR 322 получают из штамма E.coli НВ 101 pВR 322. Для этого биомассу штамма E.coli HВ 101 pBR 322 наращивают в 50 мл LB-бульона при 37^oС до плотности ОД₆₀₀= 0,8. Клетки собирают центрифугированием, суспензируют в 1 мл 5% мМ глюкозы, 25 мМ Трис-HCl рН 8, 10 мМ ЭДТА. К суспензии клеток добавляют лизоцим до конечной концентрации 5 мг/мл и инкубируют во льду 7 мин, затем к лизату добавляют 1,5 мл 5 М охлажденного ацетата калия. После 10 мин инкубации во льду лизат центрифугируют при 20 тыс.об/мин при 4^oС 60 мин. К супернатанту добавляют РНКазу до конечной концентрации 2 мкг/мл и инкубируют 40 мин при комнатной температуре. Смесь депротеинизируют 2 раза фенолом рН 8 и 1 раз хлороформом. Нуклеиновые кислоты (НК) осаждают 2,5 объемами этанола. Осадок собирают центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, подсушивают и растворяют в буфере 10 мМ Трис-HCl рН 8, 1 мМ ЭДТА, 10 мM NaCl. После этого проводят хроматографию препарата НК на сефарозе СL-2B. Фракции, содержащие ДНК, осаждают 2,5 объемами этанола. Осадок собирают центрифугированием при 5 тыс.об/мин в течение 15 мин, подсушивают, растворяют в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА рН 8, и в таком виде используют в дальнейшем.

Пример 2. Получение ДНК штамма Bacillus subtilis В-11742 Д. ДНК штамма Bacillus subtilis В-1742 Д выделяют фенольной экстракцией. Лизис суспензии клеток проводят в присутствии 0,2% SDS при 60^oС в течение 10 мин. К лизату добавляют NaClO₄ до конечной концентрации 1 М. Затем дважды взбалтывают с равным объемом смеси хлорформ-фенол рН 8 /1:1/ и один раз со смесью хлороформ-изоамиловый спирт /24:1/. После этого к супернатану добавляют 2,5 объема этанола и оставляют до образования осадка нуклеиновых кислот. Осадок собирают центрифугированием при 5 тыс.об/мин в течение 15 мин, растворяют в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА рН 8, и в таком виде используют в дальнейшем.

Пример 3. Гидролиз и лигирование векторных молекул pBR 322 и фрагментов ДНК штамма Bacillus subtilis В-1742 Д.

1 мкг ДНК pBR 322 гидролизуют в буфере, содержащем 100 мМ NaCl 50 мМ Трис-HCl рН 7,5, 10 мМ МgСl₂, 1 мМ дитиотрейтол эндонуклеазой Bam НI, в течение 2 ч при 37^oС. В этих же условиях гидролизуют 10 мкг ДНК штамма Bacillus subtilis В-1742 Д. Затем проводят лигирование Bam HI-векторных молекул pBR 322 и Ваm HI-фрагментов ДНК генома штамма Bacillus subtilis В-1742 Д. Для этого препараты ДНК, гидролизованные Bam НI, смешивают, к смеси добавляют буфер, содержащий 6,6 мМ Трис-HCl рН 7,6, 5 мМ MgCl₂ 50 мМ дитиотрейтол, 1 мМ АТФ и 5 ед. ДНК-лигазы фага Т 4. Объем реакционной смеси составляет 80 мкл. Раствор инкубируют при +12^oC в течение 16 ч, затем 2 ч при комнатной температуре.

В результате реакции лигирования получают смесь рекомбинантных молекул, содержащих векторные молекулы pBR 322 и фрагменты ДНК генома штамма Bacillus subtilis В-1742 Д. Эту смесь используют в дальнейшем для клонирования в клетках E.coli. HB 101.

Пример 4. Клонирование в клетках E.coli HB 101 рекомбинантных молекул pBR 322, содержащих фрагменты ДНК штамма Bacillus subtilis В-1742 Д.

Для проведения клонирования смесь рекомбинантных молекул ДНК, полученных как описано выше в примере 3, трансформируют в компетентные клетки E.coli HB 101.

Для этого 50 мл культуры E.coli HВ 101 выращивают до ОД₆₀₀ 0,7, клетки осаждают центрифугированием суспензии при 3 тыс.об/ мин в течение 15 мин при 0^oС, дважды промывают раствором 0,1 М CaCl₂ и ресуспензируют в 0,5 мл этого же раствора. Смешивают 10 мкл рекомбинантных ДНК, 30 мкл обработанных CaCl₂ клеток E.coli HВ 101. Смесь инкубируют 20 мин при 0^oС, 2 мин при 42^oС и 2 ч в 2 мл среды LB при 37^oС с аэрацией. Суспензию высевают на агаризованную LB-среду, содержащую 40 мкг/мл ампициллина, и инкубируют 18 ч при 37^oС. Устойчивые к ампициллину клоны -Amp^R пересевают на агаризованную LB-среду, содержащую 20 мкг/мл тетрациклина и инкубируют 18 ч при 37^oС. Отбирают клоны, чувствительные к тетрациклину Тc^S. Рекомбинантные штаммы с генотипом Тс^S Amp^R используют в дальнейшей работе.

Пример 5. Отбор рекомбинантных клонов E.coli HВ 101, содержащих гены деградации 2,4-Д.

Для отбора рекомбинантных клонов, содержащих гены деградации 2,4-Д рекомбинантные клоны E. coli HВ 101 с генотипом Tc^S Amp^R пересевают в жидкую солевую среду, содержащую 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту в качестве единственного источника углерода и энергии. Состав среды следующий, г: Na₂HPO₄ 6; KH₂PO₄ 3; NaCl 0,5; NH₄Cl 1; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 0,10 на 1 л дистилированной воды, рН 7,5.

Культуру инкубируют 14 сут при 37^oС в стационарных условиях. Через 14 сут инкубации аликвоту культуральной жидкости высевают на агаризованную среду LB, содержащую 40 мкг/мл ампициллина, разлитую в чашки Петри. В результате селекции получают рекомбинантные клоны E.coli HВ 101, использующие 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту в качестве единственного источника углерода и энергии. Далее отбирают отдельный клон, обозначают его E.coli НВ 101 рМК 16. Этот клон используют в дальнейшем для сравнительного анализа процесса деградации 2,4-Д.

Пример 6. Сравнительный анализ процесса деградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, осуществляемого штаммами E.coli НВ 101 рМК 16, E.coli HВ 101 pBR 322 и Bacillus subtilis В-1742 Д.

Для проведения сравнительного анализа процесса деградации 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты получают посевной материал рекомбинантного штамма E. coli НВ 101 рМК 16, штамма E.coli HВ 101 pBR 322 и штамма Bacillus subtilis В-1742 Д.

Штамм E.coli HВ 101 рМК 16 инкубируют в 2 мл жидкой среды LB в присутствии 40 мкг/мл ампициллина при 37^oС в течение 18 ч.

Штамм E. coli HВ 101 pBR 322 инкубируют в тех же условиях без антибиотика.

Штамм Bacillus subtilis В-1742 Д инкубируют в 2 мл МПБ при +30^oС в течение 18 ч. Затем полученный посевной материал штаммов E.coli НВ 101 pBR 322 и Е. coli HВ 101 рМК 16 засевают в отдельные колбы в количестве 1 мл в 100 мл жидкой солевой среды следующего состава, г: Na₂HPO₄ 6; КН₂PO₄ 3; NaCl 0,5; NH₄Cl 1; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 0,1 г на 1 л, рН 7,5.

Культуры инкубируют при 37^oС 14 сут в условиях аэрации в термостатированной качалке в течение 14 сут.

Штамм Bacillus subtilis B-1742 Д засевают в колбу в количестве 1 мл в 100 мл жидкой солевой среды следующего состава, г: NH₄Cl 1; К₂HРО₄ 5; MnCl₂4H₂O 0,3; MgSO₄7H₂O 50; CuSO₄5H₂O 1 мг; FeSO₄ 5 мг; ZnSO₄ 0,8 мг на 1 л дистилированной воды, рН 7,0.

Культуры инкубируют при 37^oС 14 сут в условиях аэрации в термостатированной качалке.

В процессе инкубации состояние культур проверяют высевом аликвот на агаризованную среду LB, в случае E.coli HВ 101 pBR 322 и E.coli HВ 101 рМК 16, и на МПА в случае Bacillus subtilis В-1742 Д.

Через 14 дней инкубации из каждой колбы отбирают по 10 мл культуральной жидкости, клетки осаждают центрифугированием при 5 тыс. об/мин. Супертанант подкисляют до pН 2 и из него трижды экстрагируют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту равным объемом хлороформа. Хлороформ отгоняют на вакуумном испарителе, остаток метилируют эфирным раствором диазометана и переводят в 2 мл серного эфира.

Анализ содержания 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и продуктов ее деградации в культуральных жидкостях проводят на газо-жидкостном хроматографе ЛХМ-8 МД с ионизационно-резонансным детектором.

Условия проведения анализов:
стационарная фаза 5% OV -1, твердый носитель Inerton super, температура колбы 180^oС, температура детектора 220^oС, температура испарителя 230^oС;
стационарная фаза SE -30, температура колбы 160^oС, температура детектора 190^oС, температура испарителя 210^oС;
стационарная фаза 3% OV -225, температура колбы 160^oС, температура детектора 100^oC, температура испарителя 210^oС.

Результаты анализа деградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты приведены в таблице.

Из приведенных в таблице данных следует, что штамм Bacillus subtilis В-1742 Д, используя 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту в качестве источника углерода и энергии, на 14 сутки разрушает 50% от начальной концентрации гербицида. Штамм E.coli HВ 101 pBR 322 не способен использовать 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту в качестве источника питания. Рекомбинантный штамм E. coli HВ 101 рМК 16 использует в качестве источника углерода и энергии 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и на 14 сутки разрушает до 92-100% от начальной концентрации гербицида.

Из приведенных данных следует, что штамм E.coli HВ 101 рМК 16 значительно эффективнее разрушает гербицид 2,4-Д, чем штамм Bacillus subtilis В-1742 D.

С использованием фаз разной полярности проводят сравнение продуктов метаболизма 2,4-Д, накапливаемых в культуральных средах в процессе культивирования штаммов E.coli HВ 101 рМК 16 и Bacillus subtilis В-1742 Д. На чертеже приведены результаты хроматографического анализа. Сравнительный анализ графиков 1в и 1с показывает, что в процессе культивирования штаммов происходит уменьшение количества 2,4-Д и в процессе деградации гербицида накапливаются идентичные продукты метаболизма 2,4-Д.

Приведенные результаты свидетельствуют об экспрессии генов деградации 2,4-Д штамма Bacillus subtilis В-1742 Д в клетках E. coli HВ 101 в составе рекомбинантной плазмиды штамма E.coli НВ 101 рМК 16. Далее проводят анализ структуры плазмиды штамма E.coli НВ 101 рМК 16.

Пример 7. Анализ структуры рекомбинантной плазмиды штамма Е. coli НВ 101 рМК 16.

Для проведения анализа структуры рекомбинантной плазмиды из клеток культуры E.coli HВ 101 рМК 16 выделяют препарат плазмиды как описано в примере 1 для плазмиды pBR 322. Затем 1 мкг ДНК полученного препарата рекомбинантной плазмиды гидролизуют эндонуклеазой Bam HI в условиях, описанных в примере 1 для препаратов ДНК pBR 322. После гидролиза препарат рекомбинантной ДНК фракционируют методом электрофореза в 1,0% агарозном геле в трис-ацетатном буфере.

В качестве маркера используют ДНК фага λ, гидролизованного эндонуклеазой PstI.

Результаты фракционирования указывают, что рекомбинантная плазмида состоит из векторной молекулы pBR 322 и фрагмента ДНК штамма Bacillus subtilis B-1742 Д длиной 4,4 т. Фрагмент ДНК штамма Bacillus subtilis В-1742Д состоит из двух Bam HI-фрагментов длиной 3,1 и 1,3 т.п.н. Эту плазмиду обозначают рМК 16.

Пример 8. Культурально-морфологические, физиолого-биохимические и генетические особенности штамма E.coli HВ 101 рМК 16.

Штамм E. coli H 101 рМК 16 характеризуется следующими культурально-морфологическими и биохимическими признаками.

Культуральные признаки:
Аэроб. При росте на LB-агаре колонии гладкие, круглые, прижаты, блестящие, сероватые, мутные, край ровный. При росте в жидких средах LB, М9, мясопептонном бульоне образуют интенсивную муть.

Морфологические признаки:
Клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, грамотрицательные.

Физиолого-биохимические признаки:
Культура растет в приделах от 10 до 40^oС при оптимуме рН 7,0-7,5. В качестве источника углерода использует глюкозу, фруктозу, лактозу, галактозу. В качестве источника азота используют минеральные соли в аммонийной и нитратной формах, а также в органической форме-пептон, аминокислоты.

Генетические особенности:
Имеет устойчивость к ампициллину Amp^R, не имеет устойчивости к тетрациклину Tс^S.

Плазмида рМК 16 стабильно наследуется в клетках E.coli HВ 101. При поддержании штаммов E.coli НВ 101 рМК 16 в течение 3 лет на твердой питательной среде не наблюдалось утери плазмид.

Преимущества изобретения:
1. Рекомбинантный штамм E.coli HВ 101 рМК 16 и рекомбинантная плазмида рМК 16, несущая экспрессирующиеся в клетках E.coli HВ 101 гены деградации гербицида 2,4-Д штамма Bacillus subtilis В-1742 Д, получена впервые. Авторам не известны рекомбинантные плазмиды и штаммы E.coli HВ 101, обладающие свойством деградации 2,4-Д, полученные с использованием предлагаемого в заявке способа конструирования такой плазмиды и штамма, несущего ее.

2. Рекомбинантный штамм E.coli HВ 101 рМК 16 может быть использован для эффективной биологической деградации гербицида 2,4-Д.

3. Рекомбинантную плазмиду рМК 16 можно использовать для быстрого восстановления свойств деградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в клетках E. coli НB 101 в случае его элиминации с использованием метода трансформации компетентных клеток.

4. Рекомбинантная плазмида рМК 16 может быть использована в работах по конструированию новых штаммов для деградации ксенобиотиков, а также в качестве зонда в исследованиях природных штаммов, осуществляющих деградацию 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты.

5. Данные об организации генов деградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты для штаммов рода Bacillus получены впервые в результате анализа структуры плазмиды рМК 16.

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии и представляет собой рекомбинантный штамм Е.coli НВ 101 рМК 16 и рекомбинантную плазмиду рМК 16, определяющую деградацию гербицида 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты данного штамма. Сущность изобретения: получена рекомбинантная плазмидная ДНК рМК 16 путем клонировании фрагментов ДНК штамма Bacillus subtilis BKM В- 1742 Д в вектор pBR 322. Полученной рекомбинантной ДНК трансформируют штамм Е. соli, который приобретает способность к биодеградации гербицида 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. 3 с.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Штамм бактерий Escherichia coli HB 101/pMK16, осуществляющий биодеградацию 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. 2. Рекомбинантная плазмидная ДНК рМК16, содержащая гены биодеградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, размером 8,8 т.п.н. содержащая Bam HI - Bam HI фрагмент вектора pBR 322 размером 4,4 т.п.н; Bam HI Bam HI - фрагмент ДНК штамма Bacillus subtilis BKM B-1742Д длиной 1,3 т.п.н. Bam HI - Bam HI фрагмент ДНК штамма Bacillus subtilis ВКМ В-1742Д, длиной 3,1. т.п.н. генетические маркеры: ген Ap^r устойчивости к ампицилину, ген Tc^s неактивный ген устойчивости к тетрациклину. 3. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рМК 16, содержащей гены биодеградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, заключающийся в том, что вектор рBR 322 обрабатывают эндонуклеазой Bam HI, полученный фрагмент ДНК сшивают с помощью лигазы Тu с Bam HI фрагментами ДНК штамма Bacillius subtilis ВКМВ-1742Д длиной 1,3 и 3,1 т.п.н. полученными рекомбинантными плазмидами трансформируют штамм E. coli HB 101 и отбирают клоны, устойчивые к ампицилину и чувствительные к тетрациклину, из которых выделяют целевую рекомбинантную ДНК р МК16.