Способ получения препарата митохондрий головного мозга Советский патент 1992 года по МПК A61K47/00 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано в научных исследованиях по изучению энергетического метаболизма.

Известно, что энергозависимые реакции митохондрий (MX) зависят от парциального давления кислорода и углекислого газа в окружающей органеллы среде. Традиционно выделение MX и исследование их дыхательной активности проводят в ги- пероксической, по сравнению с внутриклеточной, среде, насыщенной воздухом.

Однако, данный способ обладает недостаточной точностью, так как в нем не учитывается регуляторная роль кислорода, как субстрата, в реакции образования ингибитора сукцинатдегидрогеназы-оксалоацета- та, токсическое действие кислорода на сульфгидрильные группы тиоловых ферментов митохондрий, в частности дегидрогеназ и АТФ-аз, не учитывается влияние рС02, а известно, что от его уровня зависит интенсивность процессов карбоксилирования и

декарбоксилирования, состояние карбонатной буферной системы.

Целью изобретения является повышение качества MX препарата.

Цель достигается путем продувки газовой смесью определенного состава среды выделения MX.

Отличительные признаки проявляют в предлагаемой совокупности новые свойства, что приводит к достижению нового положительного эффекта у предлагаемого решения. Применение нормоксических условий исследования дыхательной активности MX мозга позволяет, с одной стороны, полнее сохранить нативное состояние орга- нелл и, с другой - более дифференцированно оценить градации их метаболических состояний.

Способ осуществляется следующим образом.

П р и м е р 1. Для опытов используют белых крыс линии Вистар. Головной мозг после декапитации животного быстро извлекают и помещают на 10 мин в сосуд с

VI

4 (Л Ю

сл оо

охлажденной до 0°С и предварительно продутой газовой смесью (кислород 4%, углекислый газ 8%, азот 88%) средой выделения. Продувку осуществляли под контролем газоанализатора до полного на- сыщения среды, что соответствовало парциальному давлению кислорода и углекислого газа 30 и 60 мм рт.ст. соответственно. Состав среды выделения: сахароза 0,3 М, НЕ- PES 10 мМ, ЭДТА 0,2 мМ; рН 7,4. После охлаждения мозг, освобожденный от оболочек и сосудистых сплетений, продавливают через пресс с тонкими фильерами и гомогенизируют в пятикратном обьеме среды выделения при постоянной продувке гомогената газовой смесью в термостатируемом тефлон- стеклянном гомогенизаторе. Полученный го- могенат переливают в предварительно продутые газовой смесью центрифужные пробирки и герметично закрывают их крышками. MX выделяют методом дифференциального центрифугирования при температуре 0°С. Полученную грубую митохондриальную фракцию суспендируют в среде выделения до концентрации белка 50 мг/мл при постоян- ной продувке газовой смесью. Готовую для работы суспензию хранят на льду в герметически закрытой, заполненной газовой смесью пробирке.

Дыхание MX регистрируют полярогра- фически при 26°С по изменению содержания кислорода в среде инкубации. Насыщенная газовой смесью среда инкубации содержит сахарозу 0,17 М, HEPES 10 мМ. ЭДТА 0,2 мМ, KCI40 мМ, КН2Р04 5 мМ, КНСОз 8 мМ; рН 7,4. Использованные в качестве субстратов дыхания янтарная кислота 5 мМ и ее смесь с активаторами сукцинатдегидрогеназы (СДГ) /3-оксибути- ратом и а -глицерофосфатом по 3 мМ (ука- зана концентрация в среде инкубации), а также раствор АДФ насыщают в период работы указаняой газовой смесью.

Результаты исследования дыхательной активности органелл в 3 и 4 метаболических состояниях по Чансу приведены в таблице 1. В качестве контроля даны показатели дыхания MX, выделенных аналогичным способом, на средах, уравновешенных по газовому составу с воздухом (гипероксия), т.е. в общепринятых условиях изучения функционального состояния органелл. Как при окислении одного сукцината, так и сукцина- та в присутствии активаторов СДГ отмечалось существенное различие величины всех показателей дыхательной активности МХ за исключением коэффициента сопряженности окислительного фосфорилирования (АДФ/0) в нормоксических и гипероксических условиях. Отмечено возрастание в нор- моксии на 40-70% скоростей дыхания органелл во всех метаболических состояниях, увеличение на 100% диапазона дыхательной активности и снижение на 40% времени фосфорилирования.

Применение активаторов СДГ способствовало контрастированию различий состояния MX в исследуемых условиях инкубации. Так, в нормоксических условиях еще больше возрастали скорости дыхания органелл, расширялся диапазон их функциональной активности на фоне снижения времени фосфорилирования. Очевидное ин- гибирование дыхательной активности MX в гипероксии, сопровождающееся сужением диапазона функциональной лабильности, при неизменной степени сопряженности процессов окислительного фосфорирова- ния можно объяснить известными закономерностями ингибирования тиоловых ферментов, в частности, дегидрогеназ и АТ-аз, кислородом и развитием торможения СДГ оксалоацетатом. Несомненно, что подобные глубокие и труднообратимые изменения состояния системы митохондриального окисления небезразличны при анализе тонких градаций функционального состояния органелл.

Таким образом, положительный эффект предлагаемого изобретения заключается в том числе в повышении точности исследования за счет снижения токсического влияния кислорода на тиоловые ферменты MX и уменьшения накопления в органеллах ингибитора СДГ оксалоацетата.

П р и м е р 2. Применение предлагаемого препарата митохондрий для оценки состояния системы энергопродукции головного мозга крыс при циркулярной гипоксии и профилактическом введении препарата эмокси- пин. В опытах используют белых крыс самцов линии Вистар. Циркуляторную гипоксию мозга вызывают двусторонней окклюзией сонных артерий. Эмоксипин в дозе 5 мг/кг вводят внутрибрюшинно за 50 мин до ишемии.

Через 3,5 ч после начала ишемии животных декапитируют и получают препарат митохондрий мозга способом, описанным выше. В качестве контроля служили митохондрии мозга интактной группы животных, выделенные и исследуемые по методам прототипа и предлагаемого соответственно. Оценивали скорости фосфорилирующего дыхания органелл с последующим расчетом вклада окисляемой эндогенной янтарной кислоты при утилизации субстратов малат и глутамат (по 3 мМ) отдельно, а также в присутствии ингибитора трансаминаз аминоок- сиацетата (АОА) 1 мМ и активаторов сукци- нат-зависммого дыхания /3-оксибутирата () и «-глицерофосфата (о. -ГФ) (по 3 мМ). Вклад окисления эндогенной янтарной кислоты в уровень дыхательной активности митохондрий рассчитывали как разницу скоростей фосфорилирующего дыхания органелл при утилизации субстратов в присутствии АОА и активаторов СДГ и без последних. Результаты приведены в таблице 2.

Видно, что исследуемый показатель уровня окисления эндогенной янтарной кислоты (ЭЯК) в предлагаемом препарате митохондрий мозга превосходит в известном на 120% при изучении энергопродук- ции мозга животных, перенесших ишемию, и на 186% в группе, получавшей с профилактической целью препарат эмоксипин. В группе интактных животных, как видно из таблицы, различия отсутствовали. Известно, что величина вклада эндогенной янтарной кислоты и уровень дыхательной активности митохондрий отражает характер адаптивных процессов в системе энергопродукции и является весьма информативной при оценке функционального состояния органелл. Маскировка величины этого показателя в известном способе, связанная с гипероксическими условиями эксперимента не только снижает точность исследования, но и может приво- дить к качественно иным результатам, фор- мируя ложное суждение относительно

реального состояния обьекта: в группе прототипа исследуемый показатель снижается относительно уровня контроля, а в препара- те, исследуемом предлагаемым способом, повышается.

Таким образом, полученный по предлагаемому методу препарат обладает более высоким качеством за счет того, что дополнительная продувка газовой смесью сред, субстратов, и суспензий митохондрий предотвращает окисление сульфгидрильных групп тиоловых ферментов.

Результаты дыхательной активности MX мозга крыс в нормо-и гипероксически условиях эксперимента приведены в табл,1.

Результаты расчета скорости фосфорилирующего дыхания органелл приведены в табл.2.

Формула изобретения Способ получения препарата митохондрий головного мозга путем извлечения головного мозга, помещения его в среду выделения, гомогенизации, центрифугирования, отделения митохондрий и их ресус- пендирования в среде выделения, отличающийся тем, что, с целью повышения качества препарата, за счет увеличения скорости окисления субстрата и снижения времени фосфорилирования при сохранении величины дыхательного коэффициента АДР/0, среда выделения предварительно продувается газовой смесью, содержащей 4% кислорода, 8% углекислого газа и 88% азота, до полного насыщения среды.

Использование: экспериментальная медицина, биология, биоэнергетика, фармакология. Ткань головного мозга хранят в среде выделения, насыщенной газовой смесью, состоящей из 4% кислорода, 8% углекисло- го газа и 88% азота. Все операции по выделению и хранению митохондрий проводят в среде, насыщенной этой смесью. 2 табл.

Примечание: , V3, /4о-скорости дыхания MX до, во время и после фосфорилирования в ммк AT О/мин мг белка;

АДФ/0-коэфициент сопряженности окислительного фосфорилирования: Тр - время фосфорилирования в сек/мг белка. - различия с прототипом (гипероксия) достоверны при ,05.

Таблица 1

Примечание. - различия в паре (гипероксия/нормоксия) статистически достоверны при ,05; .

Таблица 2