Способ оценки функционального состояния митохондрий Советский патент 1991 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано в научных исследованиях по изучению энергетического метаболизма, а также действия на него лекарственных препаратов.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Получают митохондрии (MX) методом дифференциального центрифугирования, затем исследуют дыхание MX полярографи- чески. Среда инкубации: сахароза 0,17 М, KCI 40 мМ, трис-НС 10 мМ, KH2PO-J 5 мМ, ЭДТА 0,2 мМ, добавки АДФ по 200 нгат, субстракт окисления - сукцинат 5 мМ или

сукцинат 5 мМ + а -глицерофосфат 3 мМ - /3-оксибутират 3 мМ. По полярограмме рассчитывают следующие показатели: Ain, Va, V40. СД, ДК, Тр, АДФ/О, VaAK-Va. где V4n скорость дыхания MX в четвертом метаболическом состоянии по Чансу, нгат Ог/мин мг белка; /з - скорость фосфорилирующего дыхания, нгат 02/ мин -мг белка: Aio - скорость дыхания в четвертом метаболическом состоянии по Чансу после фосфорилирования, нгат 02/ мин мг белка: СД - коэффициент стимуляции дыхания (V3/V4n); ДК - коэффициент дыхательного контроля (Va/V/io); Tp - время фосфорилирования. с мг белка; АДФ/0 - отношение количества профосфо- рилированного АДФ к количеству потребленного кислорода: /ЗАК- /З - изменение

о о оо ю ел

скорости фосфорилирующего дыхания в ответ на добавку в среду инкубации активаторов сукцинатдегидрогеназы а-глицерофосфата и/ -оксибутирата, нгат 02/ мин-иг белка.

На основе полученных в опыте полярографических кривых известными способами расчитывают значения Х| следующих параметров: V4n, V3. V40, СД, ДК, Тр, АДФ/0. V3AK-V3.

Рассчитывают степень принадлежности /л (Х|) значений Х| измеряемых параметров терму интактные митохондрии, значения весовых коэффициентов ai для каждого измеряемого параметра, а затем показатель интактности ИФ по формуле

ИФ Ј ai -p (XI). i 1

При значении ИФ 0,5-1,0 функциональное состояние их оценивают как физиологическое, а при значении менее 0,5 - как патологическое.

При расчете ИФ по указанной формуле учитывают следующее. ДлЪ каждого 1-го измеряемого параметра методами теории нечетких множеств получают вид функции принадлежности ju (Xi) значений Xi измеряемых параметров терму интактные митохондрии по формуле

1, при MCPI - Si Xi MCPI + Si I

I + (j-gy (Xi - MCP, - Si)) КПР при Xi MCPI - Si,

I +( (MCPI-Si-X,)) КЛЕВ при Xi MCPI - Si,

где Xi - значение измеряемого параметра; MCPI - среднее арифметическое i-го параметра в группе инта ктных животных;

Si - исправленное среднее квадратиче- ское отклонение i-ro параметра в группе интактных животных;

КЛЕВ, КПР - показатель степени, который задается экспертом, например подбирается в диалоговом режиме работы с вычислительной машиной, для большинства функций принадлежности принята вторая степень,

Весовой коэффициент ai рассчитывают по формуле

а,- -,

п

2

I 1 где п - число измеряемых пэраметроп Хг

bi балл 1-10, мрисваемый каждому 1-му параметру в зависимости от важности этого параметра (баллы присваиваются группой экспертов в процессе диалогового режима

работы с вычислительной машиной).

Пример 1. Декапитируют интактную крысу, выделяют и исследуют митохондрии мозга согласно указанной методике. Для каждого из восьми параметров дыхательной активности органелл рассчитывают степень принадлежности терму интактные митохондрии. Расчет проводят относительно полученных на достаточно большой выборке средних величин соответствующих

показателей (МСр) с учетом их исправленного среднеквадратического отклонения (Si) и весового коэффициента каждого из показателей (ai), рассчитываемого с учетом присвоенных группой экспертов каждому Iму параметру балла (bi), отражающего вклад данного параметра в совокупное состояние объекта, а также показателей степени функции принадлежности измеряемого параметра терму интактные митохонДРИИ (Клев И КПр).

Все используемые в расчете величины и полученные результаты приведены в табл. 1.

Значение X (/з) равно 57,4; МСр (/з)

58,1; S (V3) 1,2, т.е. Мср (V3)- S (V3)

Х (Уз) Мер (V3) + S (V3), так как 58.1 -1,2 57,4 58.1 + 1,2, следовательно

) Указанным образом определяют

|(Х|) для всех остальных параметров. В

примере 1 все они (табл. 1) равны 1.

Далее определяют показатель ИФ;

ai y/i (Xi) 0.03-1+0.19-1 +

i 1

+0,03- 1+0,05- 1+0,05 -1+0,14-1 +

+ 0,24 1 +0,27 -1 1.

По величине коэффициента ИФ делают вывод о том, что исследуемые митохондрии

полностью соответствуют органеллам интактных животных, Полученный результат не противоречит оценке указанных митохондрий с позиций традиционно используемого подхода, Органеллы характеризуются

достаточно низкимии сравнимыми скоростями контролируемого дыхания ( и /4о). хорошей реакцией на АДФ (СД 3,1), близким к теоретически возможному в условиях окисления сукцината коэффициентом АДФ/0. Умеренное нарастание скорости фосфорилирующего дыхания в ответ на внесение в среду инкубации активаторов сукцинатдегидрогеназы (VSAK - -Уз 3,4) демонстрирует отсутствие нагрузки на систему энергопродукции. Время

фосфорилирования добавленной АДФ, ха рактеризующее совместно с коэффициента ми АДФ/0, СД и ДК состояние процессов окислительного фосфорилирования, прак тически не отличается от такового в интакт ной группе.

Таким образом, по совокупной оценке полученных данных исследуемые MX находятся в состоянии покоя, хорошо энер- гизованны, без следов предшествующей гиперактивности, процессы окислительного фосфорилирования полностью сопряжены, что соответствует понятию интакт- ные MX.

Пример 2. Под эфирным наркозом перевязывают крысе обе сонные артерии. Через восемь часов животное погибает Из мозга погибшей крысы выделяют MX, исследуют показатели их дыхательной активности. Способом по примеру 1 рассчитывают величину коэффициента ИФ (данные для расчета в табл. 2). Расчет показывает, что величина коэффициента ИФ у данных MX близка к нулю. ИФ 0,03 -0,16 + 0,19-0,00 + 0,03- 0,00 +0,05х хО.ОО + 0,05-0,00 + 0,14-0,00 + 0,24- 0,00 + +0.27-0,00 0,004. Это свидетельствует о наличии в MX тяжелых, несовместимых с жизнью клетки, патологических изменений.

По показателям дыхания органеллы имеют низкую начальную скорость окисления субстрата, извращенную реакцию на внесение в среду АДФ, отсутствие выхода в контролируемое состояние, что характеризует глубокий низкоэнергетический сдвиг, торможение и полное разобщение окислительного фосфорилирования. Полученные данные свидетельствуют о глубоких и необратимых функциональных и органических изменениях в MX, что согласуется с расчетной величиной коэффициента ИФ.

Пример 3. Под эфирным наркозом перевязывают крысе обе сонные артерии. Через три часа у животного шерсть взье- рошена, двигательная активность существенно снижена. Оценка показателей дыхания выделенных MX мозга (табл. 3) по величине коэффициента ИФ показывает наличие выраженных изменений функционального состояния в диапазоне физиологических, в данном случае компенсаторных, реакций (расчетный показатель входит в диапазон 0.5-1,0). ИФ 0,03 -0,5 + 0,19 0,5+ + 0,05 -0,5 + 0,05- 1.0+ 0,14 -0,29 + 0,24 -1.0+ + 0,27 -0.07 0,500.

MX данного животного характеризуются достаточно высокими скоростями дыхания, выраженной и правильной направленности

реакций на АДФ, отсутствием каких-либо признаков разобщения окислительного фосфорилирования, что свидетельствует об отсутствии органических и глубоких

функциональных изменений в MX. Вместе с тем, повышенная по сравнению с интак- тными MX начальная скорость дыхания, снижающаяся при энергизации после цикла фосфорилирования, сниженная скорость фосфорилизующего дыхания и минимальная, но уже извращенная реакция на активаторы СДГ говорят о наличии в орга- неллах выраженного низкоэнергетического сдвига в пределах диапазона компенсаторных возможностей MX.

Пример 4. Под эфирным наркозом перевязывают крысе обе сонные артерии. Через 3.5 ч наблюдают у животного выраженные проявления церебральной ишемии: сниженная двигательная реакция, бледные глаза, учащенное дыхание, кло- нические подергивания, переходящие в тонические судороги, слабая реакция на внешние раздражители. Через три часа

ишемии крысу декантируют, выделяют и исследуют MX мозга. Для каждого из восьми исследуемых параметров рассчитывают принадлежность терму интактные митохондрии (табл. А). Затем определяют показатель ИФ

ИФ 0,03 -1 + 0,19 -0 + 0,03 0,14 + + 0,05 -0,44 0,05 0,61 +0,14- 0 + + 0,24 -0,31 +0,27 -0,03 - 0.168.

Величина показателя свидетельствуете наличии тяжелых патологических изменений в MX. Традиционная трактовка результатов указывает на проявление глубокого

низкоэнергетического сдвига (снижение величины АДФ/0, Тр, /з, извращенная реакция на активаторы СД1). Однако MX несмотря на выраженное и прогрес- сирущее снижение компенсаторных реакций (V40 V4n) способны сохранять энергетический гомеатаз, поддерживать на минимальном уровне энергозависимые процессы. Видно, что расчетная величина коэффициента ИФ хорошо согласуется с

имеющимися в MX патологическими изменениями.

Пример 5. За 30 мин до перевязки обеих сонных артерий вводят крысе антиги- поксант бемитил (50 мг/кг внутрибрюшинно). К третьему часу ишемии животное на фоне некоторой общей заторможенности сохраняет активные двигательные реакции. Все внешние признаки выраженной церебральной ишемии отсутствуют.

Оценка состояния MX мозга по показателям дыхательной активности (табл. 5) с последующим расчетом величины коэффициента

ИФ 0,03- 1+0,19- 0,2 +0,03- 0,37 4 4 0,05 -0,97 0,05- 1 + 0,14- 0,99 f 40.24 1 +0,27- 0,79 0,771

свидетельствует о наличии изменений функционального состояния MX в диапазоне физиологических компенсаторных реакций.

Судя по показателям дыхания MX наблюдаются начальные явления низкоэнергетического сдвига (увеличение - незначительное повышение Аад на фоне снижения Тр и неизменного МДФ/0). Энергетическая регуляция в органеллах хорошо выражена (высокие значения СД и ДК), компенсаторное торможение СД1 легко убирается активаторами фермента (/ЗАК - -V3 5,8). Таким образом, в отличие от примеров 2, 5 и 3, где коэффициенты ИФ равны 0,168 и0,5 и, соответственно, наблюдаются явления низкоэнергетического сдвига крайней, глубокой и средней степеней тяжести, у исследуемых МХ-про- явления деэнергизации незначительны, что соответствует величине ИФ 0,773.

Пример 6. Под эфирным наркозом перевязывают крысе обе сонные артерии. К третьему часу ишемии у животного наблюдаются внешние признаки циркуля- торной гипоксии - учащенное дыхание, взъерошенная шерсть, сниженная двигательная активность, но у данной особи отсутствуют проявления, характерные для глубокой ишемизации мозга развития судорожной активности. Исследование MX мозга крысы с последующим расчетом величины коэффициента ИФ (табл. 6) указывает наличие патологических изменений.

ИФ-0.03 -0,55 + 0,19 -0,19 + 0,03 -0,37 + + 0,05 -0,48 + 0,05- 1 +0,14- 0.1 4-0,24 -1 +0,27 -0,07 0,41.

Оценка состояния органелл также указывает на наличие выраженного низко- энергетического сдвига, нарастающих явлений ингибирования СДГ, торможения процессов окислительного фогфорипип

вания. Однако в отличие от примера 4, где ИФ - 0,168, у животного тяжелая ишемия с судорожными припадками, не наблюдают столь выраженного разобщения окислительного фосфорилирования (АДФ/0 1,8 и 1,5 соответственно) и повышение его времени (Тр - 120,0 и 219,0 соответственно). В то же время проявления низкоэнергетического сдвига более яркие по сравнению

с примером 3, где у такого же ишемизиро- ванного животного ИФ 0,500, в частности ниже коэффициент АДФ/0, дольше время фосфорилирования, несколько ниже скорость фосфорилирующего дыхания

и величина коэффициентов СД и ДК. По анализу показателей дыхательной активности.MX в данном примере имеется больший низкоэнергетический сдвиг, чем в примере 4.

Таким образом, предлагаемый способ

позволяет с высокой точностью определить функциональное состояние MX.

Формула изобретения

Способ оценки функционального состояния митохондрий, включающий полярографическое определение скоростей дыхания до, после и во время фосфорилирования и времени фосфорилироьзния в контрольных и опытных митохондриях, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительно определяют коэффициент стимуляции дыхания и дыхательного контроля, отношение АДФ/0 и разность скоростей дыхания во время фосфорилирования в присутствии и отсутствии активатора сукцинат- дегидрогеназы, затем рассчитывают

показатель интактности ИФ по формуле

ИФ I) ai -/л (Xi).

где ai - весовой коэффициент каждого из показателей;

(Xi) - степень принадлежности значения каждого показателя X опытных митохондрий терму, соответствующему значениям данного показателя интактных митохондрий;

и при значении ИФ 0,5-1,0 функциональное состояние митохондрий оценивают как физиологическое, а при ИФ 0,5 - как патологическое.

Таблица 1

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано в научных исследованиях по изучению энергетического метаболизма, а также действия на него лекарственных препаратов. Цель изобретения - повышение точности способа. Способ заключается в измерении показателей функционального состояния митохондрий полярографическим методом у интактных и экспериментальных животных, определении показателя интактности функционального состояния (ИФ) митохондрий по формуле ИФ = Σ A_C^. *98M_I ( X_I), где A_I - весовой коэффициент каждого из показателей

μ_I (X_I) - степень принадлежности значения каждого показателя X опытных митохондрий терму, соответствующему значениям данного показателя интактных митохондрий

значение коэффициента в интервале 0,5 - 1,0 свидетельствует о принадлежности функционального состояния исследуемых митохондрий к диапазону физиологических реакций, а в интервале 0 - 0,5 - о наличии патологических изменений функционального состояния митохондрий. 6 табл.

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6