Способ отбора и обработки полоксамеров биомедицинского назначения и раствор на их основе Российский патент 2025 года по МПК G01N33/15 C08J3/00 A61K47/10 

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, фармакологии, косметологии, пищевой индустрии, ветеринарии, в частности к изготовлению медицинских изделий и лекарственных препаратов, содержащих полоксамеры - неионогенные поверхностно-активные вещества (НПАВ), представляющие аддукты полиэтиленоксида (ПЭО) и полипропиленоксида (ППО), в виде триблоксополимеров (ТБС) общей формулой ПЭО-ППО-ПЭО

Полоксамеры являются неионогенными поверхностно-активными веществами (НПАВ), представляющим аддукты или блок-сополимеры полиэтиленоксида (ПЭО) и полипропиленоксида (ППО), в виде триблоксополимеров (ТБС) следующей формулы ПЭО-ППО-ПЭО:

где а, с - ПЭО блоки, b - ППО блок. Срединный блок молекулы представлен гидрофобным, липофильным полипропиленоксидом (ППО), а оба краевых блока - гидрофильными полиэтиленоксидами (ПЭО). «Сетка» строения НПАВ типа Pluronic на Табл.1 иллюстрирует соотношение ПЭО и ППО, процентную долю ПЭО и молекулярную массу ППО блока в молекулах полоксамеров [Crutchfield М.М., Irani R.R, und Yoder J.T.// J. Am. Oil Chemists Soc. 1964, vol. 41, p.129-132]. В скобках приведены цифры, используемые при формирование номенклатурных обозначений полоксамеров.

Поверхностно-активные свойства и агрегатное состояние ТБС определяются их строением. При вариации соотношения ПЭО/ППО и величины молекулярных масс блоков сополимеров и молекулы в целом ТБС имеют разный гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ)*, критическую концентрацию мицеллеобразования, растворимость в неполярных или полярных средах и, в конечном счете, ту или иную способность повреждать либо стабилизировать мембраны и клетки, ткани биологических объектов. Гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) поверхностно-активных веществ (ПАВ) является числовой мерой того, в какой степени вещество является гидрофильным либо липофильным. ГЛБ определяется расчетом количественных соотношений соответствующих участков молекулы [Griffin, William С.Classification of Surface-Active Agents by 'HLB', Journal of the Society of Cosmetic Chemists. 1949. Т. 1 (5): 311-26.].

Метод Гриффина для неионогенных ПАВ использует формулу:

где М - молекулярная масса гидрофильной части молекулы (в полоксамерах это два блока ПЭО), а М - молекулярная масса всей молекулы.

Формула дает результат по шкале от 0 до 20. Значение ГЛБ 0 соответствует полностью липофильным (гидрофобным) молекулам, а значение 20 соответствует полностью гидрофильным (липофобным) молекулам.

Многообразие и возможность подбора полоксамеров по физико-химическим и биологическим характеристикам предопределили их разнообразное использование, в частности в фармакологии, как компонентов искусственных кровезаменителей на основе эмульсий перфторорганических соединений (ПФОС) [Lowe, К.С.and Armstrong, F.H. (1990) Adv. Exp.Med. Biol. 277, 267-276.; Omyanagi, H., Saitoh, Y., Uchida, Т., Watanabe, M., Yamanouchi, K., Yokoyama, K. and Mitsuno, T. (1992) Biomater. Artific. Cells Immobiliz. Biotech. 20, 941-949.; Forman, M.B., Ingram, D.A. and Murray, J.J. (1992) Am. Heart J. 124, 1347-1357.], вакцин [Allison, A.C. and Byars, N.E. (1991) Mol. Immunol. 28, 279-284.], средств для солюбилизации гидрофобных лекарственных препаратов [Johnston, Т.Р. and Miller, S.C. (1985) J. Parenter. Sci. Technol. 39, 83-88.; Howell, J.M., Stair, Т.О., Howell, A.W., Mundt, D.I., Falcone, A. and Peters, S.R. (1993) Am. J. Emerg. Med. 11, 134-138] и термотропных гелей, а также как отдельных самостоятельных веществ для значительного улучшения доставки и проникновения лекарственных средств [Fults, К.А. and Johnston, Т.Р. (1990) J. Parenter. Sci. Technol. 44, 58-65.; Johnston, T.P., Dunjabi, M.A. and Froelich, C.J. (1992) Pharmacol. Res. 9, 425-434.; Kabanov, A.V., Slepnev, V.I., Kuznetsova, L.E., et al. (1992) Biochem. Int. 26, 1035-1042.; Slepnev, V.L, Kuznetsova, L.E., Gubin, A.N., et al., (1992) Biochem. Int. 26, 587-595.] через гематоэнцефалический барьер [Kabanov, A.V., Chekhonin, V.P., Alakhov, et al.., (1989) FEBS Lett. 258, 343-345.], кожу [Mohamed, F.A.S.T.P. (1995) Pharm. Sci. 5, 456-460.; Misra, A.N. and Rao, V.U. (1996) Indian J. Exp.Biol. 34, 171-173.], и повышения эффективности противораковой терапии [N.S. Melik-Nubarova, О.О. Pomaza, T.Yu. Dorodnycha, et al., FEBS Letters 446 (1999) 194-198.; Kabanov AV, Batrakova EV, Alakhov VY. J Control Release. 2003 Aug 28; 91(0): 75-83. doi: 10.1016/s0168-3659(03)00211-6].

Множество видов биологической активности определяется взаимодействием полоксамеров с различными мембранам в тесно связи с поверхностно-активными характеристиками полоксамеров, с одной стороны, и составом мембран и структурно-функциональным состоянием клеток, с другой стороны. Так, адгезия к клеточным мембранам намного выше у Плюроника Р87, имеющего высокую величину ГЛБ благодаря большей доле гидрофильных ПЭО блоков (ПЕО₆₁-ППО₄₀-ПЕО₆₁) при средней молекулярной массе 7700 Да и критической концентрации мицеллообразования 0,01 вес %. Повреждающая мембраны активность, в частности для раковых клеток намного выше у Полоксамера L62 с малой величиной ГЛБ, преобладанием гидрофобного ППО блока (ПЕО₆-ППО₃₅-ПЕО₆), при относительно небольшой молекулярной массе порядка 2500 Да и с высокой критической концентрацией мицеллообразования 0,1 вес%. [Krupka ТМ, Exner АА. Structural parameters governing activity of Pluronic triblock copolymers in hyperthermia cancer therapy. Int J Hyperthermia. 2011;27(7):663-71. doi:10.3109/02656736.2011. 599828].

Амфифильность, обусловленная сочетанным вкладом гидрофильных и липофильных блоков, способствует мицеллообразованию в различных средах, расположению на границе раздела полярной и неполярной фаз, снижению межфазного натяжения. В биологических объектах, состоящих из множества мембранных структур, гидрофильная часть полоксамера располагается на поверхности мембраны, обращенной к водной среде, а гидрофобный липофильный ППО блок в той или иной мере погружен вглубь мембраны.

Широкий диапазон свойств обеспечивает возможность подбора полоксамеров для различных медико-биологических целей по ключевым физико-химическим параметрам: молекулярной массе, соотношению блоков ППО и ПЭО, растворимости в полярных или неполярных средах, величине поверхностно-активных свойств, концентрации полоксамеров [Бахрушина Е.О., Пыжов B.C., Сахарова П.С. и др.. Блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида: перспективы применения в отечественной медицине и фармации. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. 2023;13(2-1):333-344. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2023-530]. В последние десятилетия особенно возросло разнообразие биомедицинских применений полоксамеров вне дисперсных систем как самостоятельных средств. Интересно, что такие полоксамеры, как 188, могут использоваться даже в качестве стабилизаторов, повышающих плотность биологических мембран.

Проблемы подготовки ТБС полоксамеров типа проксанолов (эмуксолов) 268 и 168, предназначенных для получения инфузионных и перфузионных эмульсий ПФОС, до стерильного и апирогенного состояния были ранее решены нами [патент РФ №2157241, приоритет от 1998 г]. Суть патента в том, что полоксамер, растворенный в инъекционной воде до концентрации 10-13 вес.%, насыщали углекислым газом и затем фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Отфильтрованный раствор автоклавировали 30 минут в укупоренных флаконах и далее выдерживали при t=65-75°С в течение 12-16 ч. В результате получали стерильный и апирогенный раствор полоксамера. При этом обеспечивалось значимое уменьшение образования перекисных групп в молекуле НПАВ и перекисных соединений в растворе до физиологически приемлемого уровня (не более 100 нМ в 4% растворе полоксамера).

Однако многолетний опыт практической работы с растворами полоксамера и изготавливаемыми с их использованием эмульсиями перфторорганических соединений (ПФОС), начиная с препаратов «Перфторан», «Фторэм» и «Перфузоль» [Белоярцев, Маевский, Исламов,1983; Белоярцев Исламов, Маевский, 1983], показал, что обработка, полоксамеров по патенту РФ №2157241 не гарантирует на 100% достижение безопасности и апирогенности получаемых растворов. Это связано, как будет показано далее, с влиянием полоксамеров на целостность биологических мембраны клеток и митохондрий.

Свидетельства наличия повреждения биологических мембран некоторыми партиями полоксамера были получены на разных объектах. Так, при перфузионном сохранении изолированной почки собаки с помощью эмульсий ПФОС, приготовленных с использованием разных по поверхностной активности полоксамеров, в частности эмуксола 168 (более мягкого ПАВ) и эмуксола 268 (более сильного ПАВ, обеспечивающего получение более стабильной эмульсии ПФОС) и отдельных растворов этих же полоксамеров было обнаружено повреждение структуры и функции клеточных мембран, более выраженное с более сильным ПАВ. Повреждение проявляется сначала в приращении скорости потребления кислорода после внесения в перфузат тестирующей добавки медленно проникающего через неповрежденные мембраны субстрата - 10 мМ сукцината, окисляющегося в матриксе митохондрий, внутриклеточных органелл клеток. Без повреждения мембраны сукцинат не активирует дыхание целого органа, так как медленно поступает в митохондрии путем переноса специфическими переносчиками через клеточную и митохондриальную мембраны, лимитирующими скорость окисления сукцинат. Нет заметного повышения потребления кислорода органом с неповрежденными мембранами клеток адвентиции сосудов, паренхимы и митохондрий. Обычно даже через 6 часов перфузии добавка сукцината не вызывает значимого прироста потребления кислорода, но при возникновении повреждения мембран в течение того же времени стимулирующее действие добавки субстрата градуально возрастает в 2 - 3 раза и, наконец, через 8-10 часов в 5-10 раз. Одновременно растет перфузионное давление при неизменной скорости подачи перфузата вследствие увеличения сосудистого сопротивления из-за прогрессирующего отека ткани, почка перестает выделять мочу и отвердевает - развивается синдром «каменного» органа. Такого рода повреждения регистрируются также на изолированных кардиомиоцитах сердца крысы или культивируемых трансформированных клетках почки свиньи. В неповрежденных клетках добавка сукцината вызывает прирост скорости потребления кислорода на 20-30%. При повреждении мембран, в частности, добавкой Pluronic F68 или полоксамеров 268 с долей ППО более 20% (по ИК-спектрофотометрическим данным) дыхание стимулируется в зависимости от степени возрастания неспецифической проницаемости мембран в 3 ч- 20 раз. Одновременно нарастает деэнергизация клеток: уменьшаются суммарный пула адениловых нуклеотидов (ATP, ADP и AMP) в 2-3 раза и отношение АТР/АМР с 10 до 1. Морфологический контроль со специфическими красителями показывает, что при такой деэнергизации более 10% клеток гибнет.Причем падение отношения АТР/АМР значимо коррелирует с процентом гибели клеток (коэффициент корреляции Спирмена р=0.9; р<0.05, при n=8). Подобное падение уровня АТР описано при повреждении полоксамером Pluronic культивируемых раковых клеток [Kabanov AV, Batrakova EV, Alakhov VY. An essential relationship between ATP depletion and chemosensitizing activity of Pluronic block copolymers. J Control Release. 2003 Aug 28;91(1-2):75-83. doi: 10.1016/s0168-3659(03)00211-6. PMID: 12932639; PMCID: PMC3932490. J Control Release. 2003 Aug 28; 91(0): 75-83. doi: 10.1016/s0168-3659(03)00211-6].

Оказалось, повреждение мембран под действием полоксамеров проявляется в появлении пирогенности даже в тех условиях, когда стерилен и по Лал-тесту не удается обнаружить наличие пирогенных эндотоксинов микроорганизмов. На основании совокупности этих данных стала ясна необходимость разработки новых критериев для отбора ТБС по биологическим характеристикам, которые могут обеспечить получение более безопасных растворов этих соединений и эмульсий ПФОС. Кроме того, ранее использованные подходы были весьма трудоемки и не давали полного представления о влиянии физико-химических параметров этих соединений на биологические объекты. Постоянно требовалось сопоставлять стабильность получаемых эмульсий ПФОС и качество растворов полоксамеров, особенно при смене партий сырья, с их влиянием на электрические и сократительные свойства изолированного сердца кролика, перфузируемого по Лангедорфу, в больших статистически репрезентативных экспериментах [Ф.Ф. Беллоряцев, Б.И. Исламов, Е.И. Маевский 1983, С.И. Воробьев - диссертация, 1995]. Применявшийся подход к отбору полоксамеров наряду с дороговизной и трудоемкостью оказался не только не достаточно чувствительным, но и весьма вариабельным. Это обусловлено вариабельностью такого сложного объекта как перфузируемые сердца разных животных, так и отклонениями физико-химических характеристик препаратов, казалось бы, при одинаковых данных согласно технической документации. Физико-химические различия между формально одними и теми же полоксамерами одной и той же компании всегда превышали 10% [Н. Шенфельд Поверхностно-активные вещества на основе оксида этилена. Пер. с нем. под ред. Н.Н. Лебедева. М. Химия, 1982. 750 с].

Отсюда следовало, что необходимы тестирование по характеристикам, не включенным в нормативные документы, но позволяющим выявить свойства, существенно влияющие на биологическое качество полоксамеров. В фармацевтических официнальных и опубликованных документах ФСП 42-0086-0503-00, per. №000218/01-2001 на проксанол 268 (ОАО «НПФ Перфторан») и в технической документации японской компании Green Cross Corporation, изучавшей Pluronic F68 как компонент эмульсии Flupsol-DA [Техническая документация №5, Green Cross Corporation, Kyoto, 1987], отсутствует информация о критических для биологических объектов характеристиках полоксамеров, кроме общеизвестных структурных, указанных в «сетке» таблицы 1.

В настоящем описании представлены способы отборы ТБС по биологическим критериям, позволяющим повысить степень безопасности полоксамеров в качестве эмульгаторов и стабилизаторов эмульсий ПФОС, а также не эмульсионных компонентов лекарственных препаратов, медицинских изделий и косметических средств.

Напомним сложность проблемы подбора поверхностно-активных веществ для получения эмульсий ПФОС, обозначенную еще в 1960-х годы. Для получения кинетически и термодинамически более устойчивых субмикронных эмульсий ПФОС в большей мере подходят ПАВ, имеющие более выраженные поверхностно-активные свойства. Но высоко активные ПАВ значительно повреждают биологические мембраны. Это резко ограничивает их применение. С позиций биологической безопасности предпочтительнее использовать ПАВ с менее выраженными детергентными свойствами. Неизбежной стала необходимость отбирать ПАВ с «компромиссными» характеристиками, приемлемыми для препаратов биомедицинского назначения: фармацевтического, ветеринарного, косметического и т.п.Эти требования в полной мере относятся и НПАВ -полоксамерам. Отсюда следует необходимость отбирать полоксамеры с достаточно выраженными поверхностно-активными свойствами для того, чтобы эмульсии ПФОС были более стабильными. Но при достаточно высокой поверхностной активности полоксамеры не должны вызывать существенного повреждения биологических мембран. Особенно жестким должен быть отбор ТБС, предназначенных для получения лекарственных средств, вводимых в значительных объемах в кровоток, то есть для получения газопереносящих эмульсий ПФОС в водно-солевых средах: кровезаменителей, перфузионных сред, а также составов, в которых солюбилизированы гидрофобные лекарственные средства и иные биологически активные соединения.

Физико-химические критерии подбора эмульгирующих систем для получения субмикронных эмульсий ПФОС описаны во множестве исследований [см. исчерпывающий обзор J. Ries, 2001]. Из них следует, что каждая эмульгирующая система должна подбираться в соответствии с конкретными физико-химическими характеристиками гидрофобного ядра частиц эмульсии ПФОС и используемых технологий. Широкий ассортимент эмульгирующих систем и смесей ПФОС и перфторуглеродно-жировых основ дисперсной фазы эмульсий представлен в патенте РФ №2329788, но при этом в качестве одного из компонентов эмульгирующей системы использовался из НПАВ только проксанол-268. Оказалось, что осписанные физико-химические оценки, тестирование острой токсичности на животных и определение повреждающего влияния полоксамера 269 на гемолиз измененных осмотическими условиями эритроцитов [С.И. Волробьев Биологические и физико-химические свойства неионогенных поверхностно-активных веществ. Российский биотерапевтический журнал, раздел Биотерапия. 2009. Том 8, №3. С.3-8.] не гарантируют отбора безопасных соединений. Сошлемся на описание необходимости уменьшения концентрации гидразон-активных примесей, по-видимому представленных альдегидами и кетонами, в котором нет сведений о том, являются ли эти примеси отдельными соединениями или встроенными компонентами полимерной цепи полоксамеров. Судя по контексту речь шла о встроенных в полимер полоксамера группах. Это группы могут давать цветную реакцию образования гидразонов, будучи как в свободных низкомолекулярных примесях, так и в составе молекул полимера, где они жестко встроены и рандомизированно распределены. Поэтому избирательное уменьшение гидразон-активных примесей из полимеров в принципе трудно представить, как и то, что в одном реакторе для синтеза ТБС имеются фракции, избирательно обогащенные гидразон-активными группами. Температурные и каталитические условия полимеризации с перемешиванием практически снижают вероятность эффективно избирательного снижения концентрации полимеров с включенными в их структуру примесями «методами фильтрации и сорбции» в том виде, как это описано [С.И. Воробьев Биологические и физико-химические свойства неионогенных поверхностно-активных веществ. Российский биотерапевтический журнал, раздел Биотерапия. 2009. Том 8, №3. С3-8.]. В принципе селекции обогащенных альдегидо- и кето-группами молекул полоксамеров возможна путем подбора хроматографических приемов разделения с использованием соответствующих этим группам лигандами, привитыми к сорбенту. Однако совместные исследования, выполненные нами с сотрудниками НИОПИК Гельфер Ц.М. и Быстрицким Г.И. показали, что избежать избыточного содержания гидразон-активных групп можно лишь в результате предварительного отбора высококачественного сырья: этиленгликоля и пропиленгликоля 1 сорта, содержащих не более 0,01% ацетальдегида и пропионового альдегида, соответственно.

Кроме того, описанные экспериментальные подходы [С.И. Воробьев Биологические и физико-химические свойства неионогенных поверхностно-активных веществ. Российский биотерапевтический журнал, раздел Биотерапия. 2009. Том 8, №3. С.3-8.] устанавливали довольно высокий порог для допустимого превышения содержания гидразон-активных групп на +50% ÷ +70% от безопасного уровня, обоснованного методикой анализа воздействий на эритроциты, инкубируемые в гипотонических средах. Повреждение эритроцитов в гипотонической среде зависит от множества характеристик НПАВ и эритроцитов. Иными словами, он не позволяет сколько-нибудь избирательно определить минимальный порог опасного превышения уровня гидразон-активных примесей и гарантировать получения безопасного полоксамера по этому параметру. Проведенные нами исследования показали, что безопасная молярная концентрация гидразон-активных групп в растворе полоксамера не должна превышает расчетную молярную концентрацию полоксамера более, чем на 8-10%. Для такого «прецизионного» определения опасности примесей гидразон-активных групп требуется существенно более селективный биологический метод, предложенный в настоящем изобретении. Он заключается в использовании ранее никем для этих целей не применяемого хорошо воспроизводимого при повторах способа выявления избирательного токсического влияния гидразон-активных на окисление NAD-субстратов в изолированных митохондриях, выделенных из печени или сердца крысы. Дело в том, что эти группы избирательно ингибируют высоко чувствительный к действию альдегидов и кетонов Комплекс I дыхательной цепи митохондрий. Ингибирование развивается в присутствии 10^-5 ÷ 10^-4 М альдегидов. На Комплекс I поступают восстановительные эквиваленты от четырех дегидрогеназ цикла Кребса, дегидрогеназ спирали (3-окисления жирных кислот и из цитозоля через специальные челночные механизмы [Биохимия по Ленинджеру, том 2, 2011 г]. Комплекс I - один из важнейших генераторов трансмембранного потенциала ионов водорода на коллекторе, начальном участке дыхательной цепи митохондрий. На нем происходит синтез богатого энергией соединения АТР, выполняющих роль универсального энергетического эквивалента для всех видов работ и синтезов в клетках тканей человека и животных. Поэтому его ингибирование опасно. Предложенный нами способ отличается как высокой селективностью, так и большой чувствительностью. Он легко реализуется при окислении сугубо NAD-зависимого субстрата 3-гидроксибутирата. Именно с помощью этого теста нами было сделано заключение о необходимо использовать высокосортное сырье для синтеза полоксамеров и избегать включения в биомедицинские изделия полоксамеров в растворах которых молярная концентрация гидразон-активных групп превышает расчетную молярную концентрацию полоксамера более, чем на 8-10%. Еще в 1980 году Ю.С. Ротенберг установил, что определяемое in vitro повреждение митохондрий хорошо коррелирует с предельно допустимы концентрациями многих токсинов на уровне целого организма [Ю.С. Ротенберг Проблема влияния промышленных токсических веществ на биоэнергетические процессы организма в гигиене и токсикологии Автореф. дис.на соиск. учен. степ, д.м.н. по специальности 14.00.07. М., 1980, 47 с]

На Фиг. 1 продемонстрирован алгоритм предлагаемого нами способа выявления ингибирования дыхания митохондрий на примере исследования образцов эмуксола-268 с разным молярным содержанием гидразон-активных групп.

Подавление дыхания изолированных митохондрий печени крысы при окислении NAD-зависимого субстрата 3-гидрокисбутирата в присутствии 1вес.% эмуксола-268, в растворе которого молярная концентрация гидразон-активных групп выше молярной концентрации эмуксола на 10% (тонкая линия) и отсутствие подавления дыхания в присутствии 1вес.% эмуксола-268, в котором молярная концентрация гидразон-активных групп равна молярной концентрации полоксамера (жирная линия). Концентрация полоксамера рассчитывалась по данным о молекулярной массе, концентрацию гидразон-активных групп в растворе определяли спектрофотометрически по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином при калибровке по пирувату натрия. Объем инкубационной кюветы 1 мл. Температура инкубации 26°С. Состав инкубационной среды: 250 мМ сахарозы, 10 мМ KCl, 3 мМ KH₂PO₄, 2 мМ MgSO₄. Стрелками показано моменты последовательных добавок: V1 - скорость дыхания митохондрии (3 мг белка на мл) в отсуствии субстратов; V2- скорость дыхания в присутствии 5 мМ 3-гидроксибутирата; V3- скорость дыхания после добавления 10 мкМ разобщителя окислительного фосфорилирования - С1ССР (видно, что дыхание не активируется в присутсвии примесей - тонкая линия); V4- скорость дыхания после добавления 5 мМ сукцината, флавин-зависимого субстрата. По оси абсцисс время в сек., по оси ординат скорость потребления кислорода в мкм в мин на мг белка митохондрий.

Видно, что ингибирование дыхания митохондрий выявляется при окислении NAD-зависимого субстрата 3-гидроксибутирата. Особенно велико ингибирование, если молярная концентрация гидразон-активные групп на 8-10% превышает расчетную молярную концентрацию полоксамера в растворе (тонкая линия регистрации кинетики потребления кислорода на фиг 2) - скорость V3 из-за присутствия примесей практически не растет, хотя разобщитель снимает все ограничения с дыхательной цепи, которые обусловлены аппаратом сопряжения - трансформации и аккумуляции энергии. При этом сохраняется скорость разобщенного дыхания митохондрий, окисляющих флавин-зависимый субстрат сукцинат (полужирные кривые, скорости дыхания V₃, и V₄, на Фиг. 2), так как ингибированием не затрагивается Комплекс II.

С точки зрения фармацевтических регламентаций неотъемлемой частью отбора полоксамеров является обеспечение прогностической оценки пирогенных свойств ТБС, не связанных со стандартными причинами пирогенности. Согласно канонам фармакопеи пирогенные реакции вызывают растворы, в которых обнаруживаются бактериальные эндотоксины, микроорганизмы или некоторые виды бактериофагов. Наши исследования показали, реальность ситуации, в которой готовые стерильные (по данным микробиологического контроля) растворы полоксамеров, не содержащие эндотоксинов (по результатам ЛАЛ-теста) могут оказаться пирогенными (выявлено в испытаниях на кроликах). Возникло предположение, что пирогенность вызвана другими причинами, обусловленными самим взаимодействием полоксамеров с мембранами, вызывающим повышение проницаемости мембран, достаточным для запуска так называемых футильных трансмембранных циклов. Мембранные футильные циклы рассеивают энергию трансмембранных градиентов ионов в виде тепла. Механизм диссипации энергии трансмембранных градиентов выглядит одинаково на уровне различных мембран. Наиболее известный пример описан при адаптации к холоду в 1962 году [В.П. Скулачев Соотношение окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи. Из-во АН ССССР, М. 1962, 126 с]

В дыхательной цепи, локализованной во внутренней мембране митохондрий, энергия окислительно-восстановительных реакций трансформируется в трансмембранный электрохимический потенциал (градиент) ионов водорода ΔμН⁺ с величиной заряда порядка 180-200 мВ и аккумулируется, в частности в ферментативном синтезе универсального энергетического эквивалента аденозинтрифостфата (АТР) из аденозиндифосфата (ADP) и неорганического фосфата (Рн) [В.П. Скулачев, А.В. Богачев, Ф.О. Каспаринский Мембранная биоэнергетика М. МГУ, 2010, 368 е.]. Этот потенциал ΔμН⁺ может быть частично израсходован в митохондриях на 1) аккумуляцию катионов калия и кальция (при этом создается более чем 100000-й градиент по Са²⁺), 2) на транспорт различных органических субстратов энергетического и пластического обмена (карбоновых кислот, аминокислот и т.п.), 30 Обмен АТР на ADP и Рн и т.д. АТР митохондрии поставляют для всех видов энергетических нужд клеток. При повреждении «проколе» мембраны нарушается генерация ΔμН⁺ и падает градиент ионов Са²⁺, например в результате действия протонофоров (проводников ионов водорода) или встраивании в мембрану кальциевого и иного катионного переносчика, образования временной проницаемой поры при деэнергизации и запуске программируемой гибели клеток. Неспецифическая проводимость мембран появляется, как правило, вследствие повреждения мембран токсинами или специфическими микробными агентами, природными и искусственными пирогенами, детергентами. Прокол мембраны - это рассеивание энергии в виде тепла. Система трансформации энергии в этом случае работает вхолостую. Создается «вертушка» ионов на мембране - футильный цикл, рассеивающий огромное количество тепла. Масштаб действия таких мембранных «нагревателей» огромен. Достаточно напомнить, что в физиологических условиях реакции энергетического обмена и окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи обеспечивают только 50-60% трансформации и аккуляции энергии. При таком КПД до 60 кг АТР образуется и расходуется в сутки для обеспечения нужд организма. В энергетическом эквиваленте это составляет от 850 до 1000 килокалорий (ккал) в зависимости от реальных условий, функционального состояния клеток и системы гомеостаза. Легко посчитать, что при 50% КПД суммарные расход энергии составляют от 1700 до 2000 ккал. Это более половины энергии, требующейся человеку массой 70 кг в сутки в состоянии покоя или довольно умеренной активности. Естественно, триллионы митохондрий не страдают от рассеивания энергии одновременно (это была бы мгновенная гибель организма). Главными митохондриальными мембранными «обогревателями» в организме являются бурая жировая ткань, печень и в меньшей степени головной мозг, сердце и почки. Второй пример, связан с функционированием потребляющего энергию натрий-калиевого насоса (Na⁺-K⁺ -АТРазой), который формирует у клеток всех тканей натрий-калиевый потенциал на наружной клеточной мембране. Na⁺-K⁺потенциал поддерживается на уровне 30-120 мВ в зависимости от вида клеток. Если происходят утечка K⁺ или беспрепятственный вход Na⁺ в клетки, то насос продолжает тратить энергию бесполезно - это тоже мощный футильный цикл: значительная часть энергии рассеивается в виде тепла. Такая активация упомянутых футильных циклов происходит при остром охлаждении для компенсации потерь тепла у всех видов птиц, животных и человека.

Итак, футильные циклы выполняет важную термогенную роль. Они активируются при изменении характера нейро-эндокринной регуляции (в первую очередь, функции щитовидной железы), при многих видах патологии (например, при гипертиреозе, воспалении, инфекциях) и приеме некоторых видов лекарственных препаратов - пирогенов. Данный контекст ограничивается вниманием к мембранному термогенезу. Не рассматриваются нарушения терморегуляции на уровне центральной и вегетативной нервной системы или сократительный термогенез, обусловленный дрожанием и интенсивным сокращением скелетных мышц.. В генетическом коде у человека и животных детерминирована система регуляции мембранного термогенеза, в частности путем синтеза белков разобщителей окислительного фосфорилирования и факторов, повышающих проницаемость мембран для различных катионов. Эти синтезы запускаются и ускоряются, когда необходим разогрев организма. Они уменьшают сопряжение окислительно-восстановительных процессов с аккумуляцией энергии в реакциях окислительного фосфорилирования в митохондриях: трансмембранный потенциал ΔμН⁺ рассеивается в виде тепла. Одновременно происходит диссипация тепла за счет выхода Са²⁺ из митохондрий (включается кальциевая вертушка). Так явления показаны при острой адаптации к холоду и ряде отклонений в гомеостазе. У новорожденных и детей раннего возраста (легко теряющих тепло) и у жителей северных широт также таким путем происходит обогрев, и основной вклад в активации термогенеза принадлежит митохондриям бурого жира и печени. Подобные сдвиги происходят при метаболических патологиях: вследствие повышения уровня длинноцепочечных жирных кислот, ацетил-КоА-производных жирных кислот и по множеству причин, вызывающих прирост концентрации свободных ионов кальция в цитозоле клеток. При патологии и ее купировании многие бактериальные токсины, вирусы, прием пирогенных препаратов (типа динитрофенола, салицилатов и т.п), некоторых антибиотиков (подобных валиномицину, нигерицину и др.) вызывают селективное или неспецифическое повышение проницаемости митохондриальных и клеточных мембран, в первую очередь для катионов. Так происходит рассеивание энергии в виде тепла, повышение температуры тела, опасный перегрев организма.

Теоретически это хорошо известно, существуют сложные термодинамические расчеты. Однако, количественные измерения рассеивания энергии в виде тепла при разобщении окислительного фосфорилирования чрезвычайно сложны, в мире описано не более 3-4 таких попыток. Нам удалось на уровне изолированных митохондрий измерить это экспериментально с помощью уникального микрокалориметра (конструкции Г.А. Котельникова и С.П. Моисеевой, Институт биологического приборостроения РАН). Измерение зарегистрировало резкое увеличение выделения тепла при разобщении окисли тельного фосфорилирования и ускорении дыхания митохондриях. На фиг.2 представлено микрокалориметрическое измерение тепропродукции в митохондриях (MX) печени крысы в зависимости от скорости окисления субстратов и активности дыхательной цепи - при синтезе АТР и при разобщении окислительного фосфорилирования. Объем термостатируемой кюветы 156 мкл, температура инкубации 26°С, частота вибромешалки 20 гц, амплитуда 1 мм. Добавки делали в объеме 2 мкл. Перед внесением в камеру добавки термостатировали в течение 30-40 сек. Конечная концентрация MX по белку 1 мг/мл. Состав инкубационной среды: 125 mM KCl, 3 mM KH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 0,25 mM ЭГТА (ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid -комплекообразователь, связывающий ионы кальция), 10 mM буфера HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-l-yl]ethanesulfonic acid), рН среды 7,4. Конечная концентрации окисляемых субстратов: 5 mM сукцината, 5 mM 3-гидроксибутирата, 0,25 mM глутамата. Добавки: ADP - 90 mkM, разобщитель окислительного фосфорилирования СССР (карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон) - 1mkM. Буквенные обозначения кривых: а - окисление сукцината в присутствии ADP, b - окисление 3-гидроксибутирата в присутствии разобщителя СССР, с - окисление сукцината в присутствии разобщителя СССР, d - окисление сукцината и глутамата в присутствии разобщителя СССР По шкале абсцисс - время t в сек, по шкале ординат теплопродукция Q в микроваттах.

Видно, что в сопряженных митохондриях при окислении сукцината в процессе фосфорилирования добавленного ADP освобождается минимальное количество тепла (кривая а). Разобщении окислительного фосфорилирования протонофором СССР вызывает значительную теплопродукцию, пропорциональную скорости окисления субстрата: (кривая b) выделение тепла при окислении 3-гидроксибутирата - в 3 раза меньше, чем при окислении сукцината (кривая с), так как сукцинат окисляется как минимум в 3 раза с большей скоростью. Предварительно до микрокалориметрии проверялось состояния выделенных митохондрий по скоростям дыхания, показателям сопряжения окислительного фосфорилирования (величинам дыхательному контроля (ДК), отношения ADP/O и скоростям фосфорилирования). Дело в том, что в процессе хранения митохондрии утрачивают часть энергетического потенциала. Поэтому не убирается оксалоацетат - продукт окисления сукцината в цикле Кребса. Поскольку оксалоацетат является конкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы - фермента окисляющего сукцинат, постольку при резком ускорении окисления сукцината в разобщенном состоянии часть сукцинатдегидрогеназной активности заингибирована оксалоацетатом. Для ликвидации конкурентного оксалоацетатного торможения в среду вносили вместе с сукцинатом глутамат, который быстро убирает оксалоацетат, вовлекая его в трансаминирование, и тем самым позволяет регистрировать свободное от ингибирования разобщенное окисление сукцината. Как видно (кривая d), при добавлении к сукцинату глутамата наблюдается максимальная для данного образца митохондрий диссипация тепла. Корреляция чрезвычайно высока между теплопродукцией и промеренными скоростями дыхания митохондрий в этих же условиях (приведены далеко не все экспериментальные данные). Коэффициент корреляции по Спирмену достигает 0.9 ÷ 1.0 (р<0.01).

Следовательно, можно с уверенностью оценивать теплопродукции, измеряя скорости потребления кислорода и степень активации или разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования. Соответственно далее оценивалась вероятность включения мембранного термогенеза за счет разобщения окислительного фосфорилирования в митохондриях при контакте с полоксамерами ЭО-ПО-ЭО.

Митохондрии (MX) выделяли методом дифференциального центрифугирования из ткани печени крыс самцов линии Wistar. Сопряженное потребления кислорода при окислении добавленных субстратов и акцептора энергии ADP с фосфорилированием (аккумуляцией энергии) регистрировали при инкубации MX в термостатируемой ячейке при температуре 26°С в среде, оптимизированной для определения параметров сопряжения окислительного фосфорилирования (таблица 2). Приведено приращение скорости фосфорилирования ΔVф - интегрального показателя сопряжения окислительного фосфорилирования и скорости дыхания. Уф рассчитывается как произведение скорости потребления кислорода во время фосфорилирования добавленного ADP и отношения ADP/O, отражающего эффективность использования кислорода в процессе аккумуляции АТР в дыхательной цепи митохондрий.

В таблице 2 показано влияние полоксамеров на скорость фосфорилирования в изолированных митохондриях и на прирост культивируемых клеток линии Raji в зависимости от молекулярной массы (ММ) и доли ППО-блока в молекуле полоксамера.

Регистрация дыхания митохондрий показала, что в присутствии ТБС может наблюдаться снижение эффективности окислительного фосфорилирования - признак диссипации трансмембранного потенциала в виде тепла. Снижение Уф обусловлено падением коэффициента ADP/O. Следовательно, для фосфорилирования добавленного ADP в АТР требуется больше потратить кислорода из-за разобщения окислительного фосфорилирования.

Подобную ситуацию, как мы описывали выше, создают все вещества, повреждающие мембраны и повышающие проницаемость, в первую очередь, для катионов. Предположение о подобном механизме пирогенного действия стерильных, не содержащих эндотоксины растворов полоксамеров, было проверено экспериментально. В испытания брали образцы стерильных растворов полоксамеров, в которых не были выявлены эндотоксины, в том случае, если они вызывали пирогенные реакции у кроликов. Исследовалось влияние этих растворов на изолированных митохондриях и эритроцитах по способности разобщать окислительное фосфорилирование и по выходу ионов калия из эритроцитов. Наиболее чувствительным показателем оказалась степень разобщения-сопряжения окислительного фосфорилирования в присутствии пирогенных растворов полоксамеров. Для этого достаточно было обнаружить падение Уф в присутствии 1,0 вес. % полоксамера в инкубационной среде. Обнаружено, что полоксамеры с более выраженными поверхностно-активными свойствами, обусловленными большей долей ППО-блока, в большей степени разобщают окислительное фосфорилирование. Показана жесткая корреляция между величиной гидрофобного блока ППО в диапазоне от 39% до 17% в составе полоксамеров и степенью повреждения митохондриальной мембраны, что проявляется в разобщающем действии полоксамеров на окислительное фосфорилирование: снижении скорости фосфорилирования АТР и падении отношения ADP/O. Коэффициент корреляции по Спирмену (между ΔVф и величиной доли гидрофобного блока ППО в составе полоксамера) отрицательный: р=-0.95, (n=5, р<0.05). То есть при большей величине гидрофобного ППО-блока в молекуле полоксамера наблюдается меньшая величина Vф.

В инфузионно-трансфузионной терапии такое происхождение пирогенности до настоящего времени никем не учитывалось. Возможно, его оценивали как непрогнозируемую нежелательную побочную реакцию, вероятность развития которой может сыграть неблаговидную роль, особенно при массивном внутрисосудистом введении эмульсии ПФОС, содержащей достаточно высокую концентрацию полоксамера (до 4%). Использование предлагаемого теста в качестве критерия, позволит выбрать партии и образцы полоксамеров, растворы которых не будут инициировать активацию мембран-зависимого термогенеза и связанной с ним «непрогнозируемой» пирогенности.

Отметим, что статистически значимой корреляции между разобщением окислительного фосфорилирования в митохондриях и влиянием полоксамеров на жизнеспособность и рост культивируемых клеток (табл.2 последний ряд) обнаружить не удалось. Это связано с тем, что прирост количества клеток в культуре обусловлен интегральным действием множества факторов.

Поскольку циркулирующие в кровотоке клетки крови в первую очередь контактируют с полоксамером, введенном внутрисосудисто в виде раствора или в составе эмульсии ПФОС, постольку целесообразно было исследовать влияние необычно пирогенного раствора полоксамера на целостность мембраны эритроцитов путем регистрации выхода из эритроцитов ионов калия по градиенту концентрации, поддерживаемому на клеточной мембране энергозависимым натрий-калиевым насосом. Обнаружено, что пирогенные образцы полоксамера в концентрации 1,0 вес. % инициируют появление выходящего потока ионов калия после кратковременной инкубации эритроцитов в присутствии полоксамера. Измерение выполнялось в присутствии и в отсутствии оуабаина - блокатора натрий-калиевого насоса (фиг.3). Выявление повреждения эритроцитарной мембраны является окончательным аргументом в отбраковке исследуемого образца полоксамера как непригодного к использованию для получения эмульсий ПФОС или растворов полоксамера инфузионного назначения вследствие опасности развития пирогенности, деэнергизации и снижения жизнеспособности клеток.

На фиг.3 представлена схема регистрации выхода ионов калия их эритроцитов крысы, предварительно инкубированных в течение 30 мин в растворе 0,15 мМ хлорида натрия и 10 мМ глюкозы без полоксамера (черные линии е, f) и в присутствии 1 вес % полоксамера-127 (серые линии g, h); жирные линии (е, g) - преинкубация без оуабаина (ингибитора натрий-калиевого насоса); тонкие линии (f, h) - преинкубация в присутствии 0,1 мМ оуабаина. Буквенные обозначения у фигурных стрелок j - диапазон различий между количеством калия, выходящего из эритроцитов, преинкубированных без оуабаина (е) и с оуабаином (f); к - диапазон различий между выходом калия для эритроцитов, преинкубированных в присутствии полоксамера-127 без оуабаина (g) и с оуабаином (h); n₁ и n₂ количество ионов калия, вышедших после разрыва эритроцитов, преинкубированных без полоксамера и с полоксамером-127, соответственно. Стрелка 1 показывает момент внесения суспензии эритроцитов в инкубационную среду: стрелкой 2 отмечено внесение в среду 0.1% тритона Х-100детергента, вызывающего разрыв мембраны эритроцитов. По шкале абсцисс указано время регистрации в мин. Слева приведены кривые калибровки калий-селективного электрода равными добавками (3,4,5,6,7,8,9) раствора КС1 - получается полулогарифмическая шкала ординат.

Заметим, что физико-химические методы определения ММ (хроматографическое, ИК-спектрометрическое и Н-ЯМР-спектроскопическое) образцов полоксамера по величине ППО блока и по соотношению ППО/ПЭО блоков не могут заменить биологические тесты, но могут быть хорошими исходными ориентирами для определения необходимости последующего применения биологического тестирования.

Следующим важным элементом отбора является проверка возможности защиты с помощью растворов полоксамера биологических мембран и липосом от повреждения, вызываемого перекисным окислением липидов (ПОЛ). Экспериментально установлено, что выбранные согласно вышеизложенным критериям полоксамеры типа эмуксол 168 и эмуксол 268, взятые в концентрации от 0,1 до 1%, способны тормозить скорость ПОЛ мембран митохондрий. Причем в присутствии эмуксола 268 время инициации ПОЛ сокращается, тогда как эмуксол 168 удлиняет время инициации ПОЛ. При этом оба полоксамера в равной степени уменьшают скорость ПОЛ. Эффекты 0,1% растворов полоксамеров приведены в табл. 2. Эта же закономерность наблюдается при увеличении концентрации полоксамеров до 0,9-1,0%. И воспроизводится на фосфолипидных липосомах со средним диаметром порядка 150 нм. Липосомы получали с помощью гомогенизатора высокого давления, так на препаратах, полученных ультразвуковым диспергированием наблюдается спонтанная активация ПОЛ.

В табл.3 представлено изменение характеристики ПОЛ мембран митохондрий, инициированного железо-аденилатным комплексом (приведены средние цифры 3 повторов каждой пробы. Из приведенных данных следует, что для обоих видов выбранных полоксамеров в концентрации 0,1% характерна тенденция тормозить ПОЛ в равной степени, но с учетом препятствия инициации ПОЛ - значимого увеличения времени инициации ПОЛ эмуксолом-168 и, напротив, сокращением времени инициации ПОЛ под влиянием эмуксола-268 предпочтение должно быть отдано эмуксолу-168.

Представленные данные дают возможность оптимизировать последовательность выполнения тестирования при отборе полоксамеров, предназначенных для использования в качестве компонентов эмульгирующей системы в эмульсиях ПФОС или самостоятельных препаратов биомедицинского назначения. Понятно, что на первом месте должно быть выявление способности у раствора полоксамера, взятого в рабочей концентрации (в той, которая будет в готовой форме медизделия или лекарственного препарата и может оказаться в кровотоке) повреждать биологические мембраны эритроцитов и митохондрий. Это обусловлено тем, что повреждение мембран способно вызывать, как минимум, пирогенные реакции. Едва ли может приветствоваться такой повреждающий эффект и при наружном или аэрозольном применении. В случае обнаружения повреждения мембран, если такая цель не преследуется специально, испытываемый образец отбраковывается, и нет смысла проводить последующие исследования.

Если повреждающее действие у растворов полоксамеров, взятых в требуемой концентрации, не обнаружено, то следующим должно быть определение молярной концентрации гидразон-активных групп и сопоставление их с молярной концентрацией полоксамера в растворе. В случае превышения молярной концентрации гидразон-активных групп над молярной концентрацией полоксамера в растворе необходимо проверить, будут ли эти растворы подавлять окисление NAD-зависимого субстрата 3-гидроксибутирата в изолированных митохондриях (проще всего работать на митохондриях, выделенных из ткани печени животных).

При потребности обеспечить стабилизирующее мембраны и антиоксидантное действие со стороны полоксамера следует проверить влияние раствора полоксамера на инициированное перекисное окисление липидов мембран митохондрий (для повышения чувствительности теста лучше использовать митохондрии, подвергнутые замораживанию/ оттаиванию) и при необходимости на липосомах.

Как ясно из правил оборота лекарственных препаратов, предназначенных для внутрисосудистого введения, одним из важных требований к технологии их получения является обеспечение не только стерильности, но и отсутствие пирогенных свойств. Пирогенность ликвидируют с помощью специальных приемов обработки субстанций и препаратов. Ранее нами был предложен способ [патент РФ №2157241, приоритет от 1998 г] депирогенизации. обеспечивающих их стерилизацию и ликвидацию, обусловливаются ены бактериальных эндотоксинов или микробнымие. Для этого разработаны одним из и указывалось, существенным фактором при отборе полоксамеров является отсутствие действием является тепловая депирогенизация полоксамера. В связи с этим нельзя не упомянуть, что стандартная тепловая стерилизация растворов полоксамеров типа Pluronic путем автоклавирования или прогревания при высоких температурах непригодна, так как сопровождается нарушением структуры молекул, стабильности их в водных растворах, осаждению и спеканию. Эмульсии ПФОСов, полученные с помощью таких полоксамеров после автоклавирования утрачивают свою дисперсность. ПО патенту Пушкина СЮ. предлагается в качестве метода депирогенизации обработка перегретым паром, очевидно это обусловлено недостаточной эффективность стандартной тепловой депирогенизации по аптентуц Маевского и др. При этом утверждается, что имеет место выигрыш по времени, Однако обработка паром технологически не столь проста, как утверждают авторы и не экономит рабочее время, так как тепловая депирогенизирующая экспозиция прводитсчя вне рабочего времени - закупоренные флаконы с растором стерилированог полоксамера выдерживаются в термостате в ночное врем и к началу следующего рабочего дня вся процедура завершается. Другое дело, что в цитируемом патенте Маевского и в ФСП на проксанол указаны широкие и (получаетося станлратные для разных видов полоксамеров диапазоны температуры при длительоной (ночной экспозиции готоого раствора.

В результате исследования нам впервые удалось установить в каком диапазоне температур должна осуществляться депирогенизирующая тепловая экспозиция для конкретного образца стерильного образца концентрированного полоксамера. Указанный диапазон устанавливается экспериментально по светопропусканию, измеряемому кинетическим турбодиметром или спектрофотометрически и не только как промежуток между температурой помутнения при нагревании и температурой начала восстановления прозрачности при последующем охлаждении для конкретного соответствующего концентрированного (4÷25 вес.%), а не разведенного (как это делается в стандартных условиях), готового стерилизованного раствора полоксамера. Это обусловлено тем, что в процессе изготовления эмульсий ПФОС используется стерильный концентрированный, а не разведенный раствор полоксамера в качестве компонента эмульгирующей системы. Такой выбор температурного диапазона для соответствующего стерильного раствора конкретного полоксамера, снижает вероятность применения неадекватного данному составу диапазона температурной депирогенизации и уменьшает затраты времени, связанные с необходимостью проведения эмпирического подбора нужных условий методом проб и ошибок и уменьшает затраты электроэнергии, обусловленный избыточным нагреванием. Одновременно такой способ предотвращает вероятность установления недостаточной температуры нагревания, не обеспечивающей депирогенизацию, и напротив, избыточный перегрева, в результате которого могут произойти необратимые изменением структуры полимера и уменьшение его поверхностно-активных свойств.

Представленные материалы демонстрируют решение задачи получения биологически приемлемых, непирогенных, не повреждающих биологические мембраны растворов триблосополимеров ЭО-ПО-ЭО путем введения новых критериев отбора: биологического тестирования преимущественно с помощью изолированных митохондрий благодаря относительной простоте и воспроизводимости метода и физико-химического контроля путем определению адаптированным методов критического уровня содержания гидразон-активных аледегидо- и кетоггрупп в растворе триблоксоплимеров ЭО-ПО-ЭО и степени восстановления прозрачности очищенного раствора при охлаждении после завершающей процедуры длительного прогревания.

Таким образом, нами предложен способ отбора полоксамеров биомедицинского назначения, заключающийся в последовательном тестировании, при котором первоначально измеряют способность образца полоксамера повреждать проницаемость биологических мембран, обнаружение которой является критерием отбраковки взятого образца полоксамера, освобождающим от необходимости проводить последующие процедур отбора, и включающий исключение полоксамеров, не препятствующих развитию перекисного окисление липидов; обладающих способностью повышать проницаемость биологических мембран; способных ингибировать дыхание митохондрий тканей животных; содержащих молярную концентрацию гидразон-активных групп более чем на 10% превышающую расчетную молярную концентрацию полоксамера в растворе, где повреждение проницаемости биологических мембран оценивают путем измерения разобщения окислительного фосфорилирования в митохондриях и инициации неспецифической проницаемости биологических мембран для катионов. При этом способ отбора полоксамеров биомедицинского назначения, отличается тем, что молярная концентрация гидразон-активных групп в растворе полоксамера не должна повышаться до уровня, ингибирующего потребление кислорода при окислении NAD-зависимых субстратов в митохондриях тканей животных. В процессе отбора полоксамеров биомедицинского назначения могут выбираться полоксамеры, способные в концентрации от 0,1 вес.% до 1,0 вес.% подавлять инициированное перекисное окисление липидов биологических мембран и липосом. Также при обработке полоксамеров биомедицинского назначения может проводится депирогенизирующаяй тепловая экспозиция при температуре в диапазоне между температурой помутнения при нагревании и температурой начала восстановления прозрачности при охлаждении, при которой до начала тепловой депирогенизирующей экспозиции измеряют с помощью динамической турбодиметрии температурный диапазон между температурой помутнения при нагревании и температурой начала восстановления раствора полоксамера. На основании данного отбора может быть получен раствор биомедицинского назначения.

Пример1. Навески по 200 г четырех образцов коммерческих полоксамеров (сухие чешуйчатые по виду сырья - F, согласно номенклатурной сетке табл.1 описания), содержащие согласно паспорту 20% НИО-блока в молекуле: эмуксол-168 (№ 4, порядковые номера во всех случаях присвоен нами), эмуксол 268 (№14), эмуксол 268 (№15), Pluronic F68 (№ 24) разведены каждый в 1 л инъекционной воды. Полученные 20-процентные растворы полоксамеров профильтрованы в стерильных условиях через пластинчатые фильтры с порами 0,22 мкм и разлиты по 200 мл в стерильные флаконы для кровезаменителей, затем подвергнуты щадящему автоклавированию в течение 20 мин (согласно патенту . Из каждого образца взято по 2 мл для турбодиметриического испытания для определения температуры помутнения при нагревании и последующего восстановления прозрачности при охлаждении на регистрирующем турбидиметре с соотвествующими градиенами температры, (ступенчатое повышение или псолежующее понижение температуры на каждые 4°С при длительность ступеньки 3 мин) с постоянной регистрацией светопропускания на длине волны 580 нм. Для каждого образца определен диапазон температур между температруой помутнения и последующей температурой восстановления прозрачности при охлаждении. Согласно этим измерения выбраны режимы температурной депирогенизации для каждого образца при стандартном времени экспозиции 12 часов. Затем образцы проверены в микробиологической лаборатории на стерильность (НИ центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов), на наличие эндотоксинов по ЛАЛ-тесту (АНО Институт инженерной физики) и пирогенности на кроликах (ИТЭБ РАН). Все препараты согласно проведеннфм аналитияеским ислдеованиям все полученные растворы стерильны, в пределах ЛАЛ теста содержат минимуально допустиму концентраци. Эндотоксинов, но оказались разными по пирогенности, определяемогй на кроликах при внутривенном введнии раствора в концентрации 10вес.% в дозе 10 мл на кг массы тела, (согласно Фармакопейным рекомендациям). На кроликах у препаратов эмуксол-168 (№ 4) и эмуксол 268 (№14),пирогенность не выявлена , суммарные отклонения температуры не превышали 0,4°С для каждого препарата в течение 3 часов, определение выполнено на 3 кроликах для каждого препарата. У пирогенных препаратов на основе полоксамеров эмуксол 268 (№15) и Pluronic F68 (№ 24) при первоначальном и повторных измерениях суммарные отклонения температур превышали 1,1°С. Всего для проведение эксперимента по выявлению пирогенности использованы для непирогенных препаратов по 3 кролика, для пирогенных - по 6 кроликов. Параллельно образцы 4-х готовых растворов полоксамеров были оттестированы по влиянию на сопряженное с фосфорилированием дыхание митохондрий (MX), выделенных методом дифференциального центрифугирования из печени крысы. С помощью установки Рекод-4, сопряженным с процессором компьютера, регистрировали потребление кислорода V0₂- мембранным электродом Кларка, трансмембранный электрический потенциал ДМ* - селективным ТФФ⁺- чувствительным электродом, pH -потенциометрическим Н⁺- селективным электродом при инкубации митохондрий в термостатируемой четырехэлектродной кювете объемом 1 мл при 26°С. Эндогенную АТР-азную активность измеряли по приросту Н+ в присутствии добавленного АТР после исчерпания 0₂ в среде. Концентрация MX в кювете - 3 мг белка в мл. Состав инкубационной среды (ИС): 125 mM КС1, 3 тМ КН₂Р0₄, 1 тМ MgS0₄, 0,25 тМ ЭГТА, 10 mM HEPES, pH 7,4. В качестве субстрат окисления добавляли 5 тМ сукцината в присутствии 0,5 тМ глутамата. Добавки: ADP - 150 mkM, разобщителя окислительного фосфорилирования СССР - lmkM, трифенилфосфония (ТТФ+) -3 мкМ, АТР -1,5 мМ. Полученные данные представлены в таблице.

Результаты, представленные в табл. 5, свидетельствуют о том, при разобщении лктсдительного фосорилирования вследствие повреждения мембраны полоксамером наиболее показательно снижение скорости фосфорилирования Уф. При уплотнении мембраны под действием полоксамера наиболее показательным является уменьшение активности эндогенной ATP-азы, спонтанно рассеивающей энергию АТР в отсутствии поступления и аккумуляции энергии из дыхательной цепи (кончился в ячейке кислород).

Таблица 5

Пример 2. Используем растворы № 4, №14 и № 15, полученные, как описано в примере 1. Далее измеряли содержания в этих растворах альдегидо- и кето-групп по цветной реакции по методике, разработанной Корнбергом и Кребсом [Н. L. Komberg, Н. A. Krebs Synthesis of cell constituents from C2-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / // Nature. 1957. - Vol.179, №.4568. - P. 988-991]. В пробирку объемом 5 мл отмеривали 0,3 мл исследуемого раствора и добавляли 0,7 мл дистиллированной воды. Туда же добавляли 0,5 мл 0,1% раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Тщательно перемешивали закрывали фольгой и выдерживали в темном месте при комнатной температуре 20 мин. Затем приливали по 1 мл раствора 12% гидроксида натрия (NaOH) и через 5 мин колориметрировали в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 465 нм. Концентрацию альдегидо- и кето-групп рассчитывали по калибровочному графику, построенному по раствору пирувата натрия. В котором по оси ординат значения оптической плотности растворов, а по оси абсцисс соответствующее им содержание пирувата натрия (мМ). Для построения калибровочной кривой использовали растворы пирувата натрия в концентрации от 0,25 мМ до 4,0 мМ, где имеется линейная зависимость окраски о концентрации кетокислоты. Затем сопоставляли величину молярной концентрации полоксамера, исходя из расчета его молекулярной массы и начальной навески при получении 20% растворов (пример 1). Оказалось, что в растворе №4 содержится 26 мМ гидразон-активных групп при молярная концентрация полоксамера 25 мМ, в растворе № 14 - 15,5 мМ гидразон-активных групп при молярная концентрация полоксамера 15 мМ, а в растворе №15 содержится 18,1 мМ гидразон-активных групп при концентрации полоксамера 15,4 мМ. Возможно, с этим связана тенденция к ингибированию дыхания митохондрий в присутствии ADP и СССР, показанная в примере 1 именно для раствора №15 при окислении сукцината с глутаматом.

Пример 3. Все операции по приготовлении растворов полоксамеров № 14 и 15 выполняли, как в примере 1. Исследовали влияние этих растворов скорости дыхания митохондрий печени при окисление NAD-субстрата 5 мМ 3-гидроксибутирата. Все условия измерения такие же, как в примере 1, за исключением использования другого субстрата. Показано, что образец №15 тормозил дыхание в присутствии ADP на 42% (р < 0,05), а при разобщении ( в присутствии СССР) на 68% (р < 0,05), тогда как образец №14 практически не изменял скоростей дыхание (наблюдалось незначительное приращение - на 9% и 15%, соотвественно).

Пример 4. Регистрировали изменение скорости потребления кислорода изолированными митохондриями после однократного замораживание оттаивания. Эта процедура способствует более выраженной активации инициированного железо-аденилатной смесью перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран митохондрий в среде следующего состава: 150 мМ КС1, 10 тМ Трис-С1 буфера ( pH 7,3). Добавки: 1,5 мМ АТР и 100 мкМ Fe2S04. Растворы полоксамеров №4 и №14 (по примеру 1) добавляли в среду по 50 мкл (конечная концентрация полоксамеров 1 вес%) до внесения митохондрий. Концентрация MX - 1 мг белка в мл, температура инкубации 26°С, объем ячейки 1 мл. Образец № 4 задерживал увеличивал лаг-фазу инициации ПОЛ на 56% и тормозил потребление кислорода на линейном участке регистрации ПОЛ на 31%, тогда как образец №14 увеличивал лаг-фазу

Группа изобретений относится к области биотехнологии, медицины, фармакологии, косметологии, пищевой индустрии, ветеринарии. Раскрыт способ отбора полоксамеров биомедицинского назначения, заключающийся в последовательном тестировании, при котором первоначально измеряют способность образца полоксамера повреждать проницаемость биологических мембран, обнаружение которой является критерием отбраковки взятого образца полоксамера, освобождающим от необходимости проводить последующие процедуры отбора, и включающий исключение полоксамеров, не препятствующих развитию перекисного окисления липидов, обладающих способностью повышать проницаемость биологических мембран, способных ингибировать дыхание митохондрий тканей животных; содержащих молярную концентрацию гидразон-активных групп, более чем на 10% превышающую расчетную молярную концентрацию полоксамера в растворе, где повреждение проницаемости биологических мембран оценивают путем измерения разобщения окислительного фосфорилирования в митохондриях и инициации неспецифической проницаемости биологических мембран для катионов. Также раскрыт способ обработки полоксамеров биомедицинского назначения. Группа изобретений обеспечивает получение биологически приемлемых в широком диапазоне концентраций, непирогенных, не повреждающих биологические мембраны растворов полоксамеров. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 4 пр.

1. Способ отбора полоксамеров биомедицинского назначения, заключающийся в последовательном тестировании, при котором первоначально измеряют способность образца полоксамера повреждать проницаемость биологических мембран, обнаружение которой является критерием отбраковки взятого образца полоксамера, освобождающим от необходимости проводить последующие процедуры отбора, и включающий исключение полоксамеров, не препятствующих развитию перекисного окисления липидов, обладающих способностью повышать проницаемость биологических мембран, способных ингибировать дыхание митохондрий тканей животных, содержащих молярную концентрацию гидразон-активных групп, более чем на 10% превышающую расчетную молярную концентрацию полоксамера в растворе, где повреждение проницаемости биологических мембран оценивают путем измерения разобщения окислительного фосфорилирования в митохондриях и инициации неспецифической проницаемости биологических мембран для катионов.

2. Способ отбора полоксамеров биомедицинского назначения по п. 1, отличающийся тем, что молярная концентрация гидразон-активных групп в растворе полоксамера не должна повышаться до уровня, ингибирующего потребление кислорода при окислении NAD-зависимых субстратов в митохондриях тканей животных.

3. Способ отбора полоксамеров биомедицинского назначения по пп. 1, 2, заключающийся в выборе полоксамеров, способных в концентрации от 0,1 вес.% до 1,0 вес.% подавлять инициированное перекисное окисление липидов биологических мембран и липосом.

4. Способ обработки полоксамеров биомедицинского назначения, отобранных по пп. 1-3, отличающийся проведением депирогенизирующей тепловой экспозиции при температуре в диапазоне между температурой помутнения при нагревании и температурой начала восстановления прозрачности при охлаждении.

5. Способ обработки по п. 4, отличающийся тем, что предварительно до начала тепловой депирогенизирующей экспозиции измеряют с помощью динамической турбидиметрии температурный диапазон между температурой помутнения при нагревании и температурой начала восстановления раствора полоксамера.