СПОСОБ ОЧИСТКИ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА Российский патент 1994 года по МПК C07K3/12 

Изобретение относится к аналитической биохимии и молекулярной биологии. Оно может быть использовано для получения свободных от органофильных лигандов стандартных препаратов сывороточного альбумина, используемых в экспериментальной и клинической медицине, в биотехнологии, в работе биохимических, биофизических, гематологических, фармакологических и иммунологических лабораторий.

Известен способ очистки альбумина плазмы крови от связанных с ним нековалентной связью жирных кислот и минорных органофильных лигандов, который заключается в том, что исходный препарат сывороточного альбумина подвергают сначала фракционному высаливанию сульфатом аммония в интервале рН 7,0-6,0 и рН 6,0-4,0. Последнюю фракцию обессоливают и лиофилизируют. Лиофилизированный белок подвергают четырехкратной экстракции смесью этанола и хлороформа при объемом соотношении (5: 1) - (8: 1) в течение 12-18 мин при 36-38^о, причем первую экстракцию проводят с добавлением концентрированной НСl до конечной концентрации в экстрагирующей смеси 10^-3 - 10^-4 М.

Для выделения фракции нативного альбумина экстрагированный, тщательно высушенный в вакууме белок вновь подвергают фракционному высаливанию сульфатом аммония с выделением сначала высаливающейся в интервале рН 7,0-6,0 фракции, которую отбрасывают, а затем высаливающейся при рН 6,0-4,0 фракции, которую обессоливают, лиофилизируют.

Основной недостаток данного способа заключается в том, что очищенный таким образом сыворотный альбумин имеет низкую функциональную активность в качестве транспортера эндогенных органических анионов, в частности билирубина. В частности, для очищенного данным способом сывороточного альбумина человека, верблюда или крупного рогатого скота эта активность, определяемая разработанным в ИБК АН СССР методом, составляет соответственно 20,9; 21,4 и 19,1% от исходной концентрации билирубина, связанного с мембранными частицами.

Видимо это обусловлено тем, что хлороформ обладает сильным денатурирующим альбумин действием и/или тем, что хлороформ, извлекая жирные кислоты и минорные органофильные лиганды из молекулы сывороточного альбумина, может сам довольно прочно связываться молекулой белка в качестве лиганда в качестве галоидсодержащего углеводорода.

Недостаток метода заключается кроме того в том, что манипуляции с содержащей хлороформ экстрагирующей смесью при 36-38^оС небезопасны для человека, поскольку относящийся к низкокипящим галоидпроизводным углеводородам хлороформ является сильным печеночным ядом.

Недостаток метода заключается также в его сложности и громоздкости (повторные многократные экстракции, повторное фракционное высаливание белка и пр. ).

Целью изобретения является сохранение функциональной активности очищенного сывороточного альбумина в качестве транспортера эндогенных органических анионов и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что предложен способ очистки сывороточного альбумина от связанных с ним лигандов, заключающийся в том, что исходный препарат растворяют в подкисленном (концентрированной соляной кислотой) этаноле подвергают гельфильтрации, используя в качестве элюирующего растворителя подкисленный (концентрированной соляной кислотой) этанол, выделяют из элюата белок, лиофилизируют и выделяют фракцию нативного сывороточного альбумина.

Белок из элюата выделяют путем ультрафильтрации, или высаливания ацетатом натрия, или осаждения щелочью.

Фракцию нативного сывороточного альбумина выделяют из лиофилизированного очищенного белкового препарата путем гельфильтрации фракции растворенного в дистиллированной воде препарата, полученной при высаливании его сульфатом аммония при рН-5,0, и лиофилизируют.

В качестве растворителя в предлагаемом способе из всех возможных органических растворителей выбран этанол. Выбор обусловлен тем, что этанол в качестве эндогенного метаболита присутствует в системе циркуляции, постоянно контактируя с сывороточным альбумином. Этанол используют в виде водно-спиртовых смесей, в частности для систематического фракционирования белков плазмы крови. Присутствие воды в таких смесях делает необходимым тщательное и весьма сложное соблюдение разных режимов их охлаждения, меняющейся величины их ионной силы и меняющегося их электролитного состава, что позволяет получать дискретные белковые фракции, избегая денатурирующее белки действие этанола в водно-спиртовых смесях.

Удалось найти простое условие, которое позволяет использовать в качестве растворителя сухого препарата сывороточного белка не водно-спиртовые смеси, а 98% -ный охлажденный до -(5-7)^оС этанол, что полностью исключает упомянутые сложности, возникающие при работе с водно-спиртовыми смесями. Условие это заключается в определенном подкислении этанола. Впервые было обнаружено, что сухой препарат сывороточного альбумина можно практически полностью растворить в течение 7-10 мин в охлажденном до - 5-7^о этаноле, если свежеперегнанный этанол после указанного охлаждения подкислить концетрированной 11-12 н НСl до рН при 5-7^о равной 1,85-1,95 (водородный показатель свежеперегнанного этанола составляет 5,20-5,90 при 22^оС). Следует особо подчеркнуть, что понятие "водородный показатель" здесь имеет условный смысл, поскольку речь идет не о водной, а об этанольной среде, и используется только для сравнительных количественных характеристик.

Для наиболее полного растворения белка в подкисленном этаноле необходимо постоянное энергичное перемешивание первоначально возникающей суспензии в течение всего указанного времени растворения. Необходимым и достаточным условием для такого растворения является нативность белка, отсутствие гемолиза при выделении белка из сыворотки крови и практически полное отсутствие в препарате альбумина иных находящихся в плазме (сыворотке) крови белков. Максимальная концентрация растворенного в этаноле альбумина (без значительной опалесценции) составляет при этом 0,8-1,2 мг/мл.

Закисление этанола до рH_-(5-7)o_C = = 1,95, может оказаться недостаточным для растворения сывороточного альбумина (особенно тогда, когда с белком связано исключительно большое количество органофильных лигандов, в частности жирных кислот, как это бывает при работе, например, с альбумином сыворотки крови яка).

Закисление этанола до рH_-(5-7)o_C 1,85 является нецелесообразным, поскольку нерастворимость альбумина в этаноле, подкисленном до рH_-(5-7)o_C = 1,85, свидетельствует о том, что препарат альбумина либо лишен нативности, либо содержит слишком большое количество геля или его производных, либо содержит примесь иных находящихся в плазме (сыворотке) крови белков, противодействующих растворению альбумина. В модельных опытах было впервые обнаружено, что гельфильтрация этанольного раствора сывороточного альбумина при использовании подкисленного до рH_-(5-7)o_C = 1,85-1,95 этанола в качестве элюирующего растворителя позволяет добиться четкого отделения высших жирных кислот, например пальмитиновой или олеиновой кислоты, от белка. Аналитическая тонкослойная хроматография хлороформного экстракта элюированного белка, очищенного предлагаемым способом, показывает, что такая фильтрация позволяет полностью удалить из белка препарата не только неэтерифицированные жирные кислоты, но и упомянутые минорные органофильные лиганды. При общем содержании неэтерифицированных жирных кислот в исходном препарате сывороточного альбумина (в расчете на количество белка) 3-7 моль/моль общее содержание их в элюированном белке, по результатам калиброванной по пальмитиновой кислоте колориметрии Weigel W. (Die Pharmazie 1956, N 12, S 786-791), не превышает 0,001-0,002 моль/моль.

Было впервые обнаружено также, что описанная гельфильтрация позволяет отделить от растворенного в подкисленном этаноле сывороточного альбумина трихлоруксусную кислоту. Это обнаруженное обстоятельство открывает возможность использования для предлагаемой процедуры очистки альбумина, предварительно осаждаемого трихлоруксусной кислотой непосредственно из сыворотки крови Korner A Debro I. R. (Nature 1956, V. 178, N 4541, р. 1067-1069), что существенно расширяет возможности процесса очистки белка. Без описанной гельфильтрации осаждение альбумина из сыворотки крови посредством трихлоруксусной кислоты с последующим избирательным растворением осажденного альбумина является нецелесообразным с точки зрения дальнейшего использования альбумина, поскольку трихлоруксусная кислота энергично связывается осаждаемым ею альбумином (Scatchard G. Black E S//J Phys Colloid Chem. 1949, V. 53, N 1, р. 88-99).

Для выделения сывороточного белка из полученного в результате гельфильтрации элюата, как установлено в опытах, можно применить либо ультрафильтрацию, либо высаливание, либо защелачивание этанола.

Для высаливания белка из подкисленного этанола выбран кристаллический ацетат натрия. Выбор обусловлен тем, что ацетат натрия в качестве метаболита присутствует в системе циркуляции in vivo и постоянно контактирует с сывороточным альбумином, тем что ацетат натрия растворим в подкисленном этаноле, а также, что катион Na⁺ и анион СН₃СОО^- практически не связываются молекулами сывороточного альбумина.

Для выделения сывороточного альбумина из подкисленного этанола, кроме высаливания белка насыщением этанола кристаллическим ацетатом натрия, можно применять защелачивание этанола до рH_-(5-7)o_C 7,50-8,00. Такого защелачивания достигают, вводя в альбумин, подкисленный этанолом, микроколичество насыщенного (14,4 г) NaOH на тонкой стеклянной палочке при постоянном потенциометрическом контроле. При указанном защелачивании растворенный в этаноле белок полностью выпадает в осадок. При защелачивании этанола до рH_-(5-7)o_C 7,50 выпадение белка в осадок оказывается, по результатам спектрофотометрии в УФ-области надосадочной жидкости, неполным. Защелачивание же этанола до рH_-(5-7)o_C 8,0 является нецелесообразным, поскольку выпадение белка в осадок при рH_-(5-7)o_C = = 8,0 оказывается полным.

Как при высаливании белка, так и при осаждении его защелачиванием этанола необходимо тщательное перемешивание смеси с последующей 10-20-минутной инкубацией при -(5-7)^оС для более компактного оформления белкового осадка, который отделяют фильтрацией при - (5-7)^оС, и лиофилизируют.

Для выделения из лиофилизированного белка, очищенного от связанных с ним лигандов, нативного альбумина полученный препарат растворяют в дистиллированной воде, доводя водородный показатель раствора до 7,20 - 7,20 (1-2^о). При рНH_1-2o_C < <7,20 растворение лиофилизированного белка происходит очень медленно и оказывается неполным. При р H_1-2o_C 7,40 растворение происходит быстро и оказывается практически полным. Поэтому защелачивание до рH_1-2o_C > 7,40 нецелесообразно. В полученный раствор добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до его конечной концентрации 2,8-3,0 М, необходимой для высаливания сывороточного альбумина. Водородный показатель раствора белка доводят до рH_1-2o_C 6,0, добавляя микроколичество 0,2 н. НСl под постоянным потенциометрическим контролем и при постоянном перемешивании. Затем пробу оставляют на 20-30-минутную инкубацию при 1-2^оС, после чего высоленный белок отделяют центрифугированием (10000g 30 мин 1-2^оС) и отбрасывают. Водородный показатель надосадочной жидкости доводят до 5,0 (1-2^оС) и после 20-30-минутной инкубации при 1-2^оС осадок белка отделяют центрифугированием (см. выше), растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят водородный показатель раствора до 7,0 (1-2^оС), фильтруют через колонну с сефадексом G-75, используя в качестве элюирующего растворителя дистиллированную воду (рH_1-2o_C 7,0) и содержащие белок порции элюата лиофилизируют. Лиофилизированный белок представляет собой очищенный от высших жирных кислот и прочих минорных органофильных лигандов сывороточный альбумин, поскольку именно альбумины высаливают нейтральными солями в изоэлектрической точке лишь при 70-100% -ном насыщении раствора соли.

Все операции со спиртовыми растворами сывороточного альбумина выполняют при постоянной температуре - (5-7)^оС. При температуре выше -5^оС, как показали наблюдения, оказывается возможной определенная утрата белком своей функциональной активности в качестве транспортера билирубина, определяемой in vitro.

Охлаждение до температуры ниже -2-7^оС нецелесообразно, поскольку ощутимого увеличения упомянутой функциональной активности белка в сравнении с активностью, находимой при температуре -7^оС, не дает.

Все операции с водными растворами сывороточного альбумина проводят при постоянной температуре 1-2^оС. Такое предельное охлаждение необходимо, поскольку освобожденный от органофильных лигандов сывороточный альбумин очень чувствителен к повышению температуры среды. Охлаждение до температуры ниже 1^оС является нежелательным из-за опасности замерзания водных сред. Охлаждение до температуры выше 2^оС нежелательно из-за упомянутой термолабильности очищенного альбумина.

П р и м е р 1. Для гельфильтрации использовали стеклянную вертикальную колонку (40х2,5 см), полностью окруженную стеклянным кожухом, в нижней части которого предусмотрен специальный "отросток" для удаления накапливающейся во время работы в пространстве между колонкой и кожухом талой воды. Это пространство полностью заполняли смесью льда и NaCl (8-12% ), охлаждавшей содержимое колонки до -(4,9-7,5)^оС. Колонку заполняли сефадексом LH60 после суточного набухания его в подкисленном 98% -ном этаноле при -(4,9-7,5)^оС. Такой же подкисленный этанол использовали в качестве элюирующего растворителя при скорости его протекания через колонку 1,5 мл/мин. Колонку считали готовой к работе при полном отсутствии поглощения света при λ 280 нм получаемыми порциями элюата.

Навеску (15 мг) сухого сывороточного альбумина человека (Станция переливания крови, г. Витебск), помещали в охлажденный до -(4,8-7,5)^оС стеклянный бюкс с ферромагнитным перемешивающим элементом. В бюкс отмеривали 10 мл охлажденного до -(4,9-7,5)^оС 98% -ного этанола и 3,5 мкл 11 н. НСl (конечная концентрация НСl составляла в данном случае ≈ 3х10^-3 М). При постоянном энергичном перемешивании содержимого бюкса полное растворение белка происходило в течение 7 мин.

Полученный этанольный раствор альбумина наносили на колонку с сефадексом LН60. Элюцию белка производили в указанном выше режиме, используя спектрофотометрию получаемых порций элюата (D₂₈₀) для построения профиля элюции. Содержавшие белок порции элюата, идентифицированные по поглощению света при λ 280 нм, объединяли и затем подвергали ультрафильтрации, используя для этого фильтрационную ячейку ФМ 02-10. Выделенный ультрафильтрацией белок лиофилизировали.

Для выделения из препарата очищенного белка нативного альбумина лиофилизированный белок растворяли в 2-3 мл охлажденной до 1-2^оС дистиллированной воды (рH_1-2o_C 7,4). В раствор белка добавляли кристаллический сульфат аммония до конечной концентрации его 28 М при постоянном энергичном перемешивании смеси. Добавлением 0,1 н. НСl водородный показатель доводили до 6,0. Высоленный белок отделяли центрифугированием (18000 g, 1-2^оС, 10 мин) и отбрасывали. Добавлением 0,1 н. НСl водородный показатель надосадочной жидкости доводили до 5,0. Высоленный белок отделяли центрифугированием в том же режиме. Осадок растворяли в 1,0-1,5 мл дистиллированной воды (рH_1-2o_C 7,0). Раствор белка наносили на колонку с сефадексом G - 75. В качестве элюирующего растворителя использовали дистиллированную воду (рH_1-2o_C = 7,0). Содержавшие белок порции элюата, идентифицированные по поглощению ими света при λ 280 нм, объединяли и лиофилизировали. Выход очищенного нативного лиофилизированного белка составил 9,8 мг (65% ). Его определяемая in vitro функциональная активность в качестве транспортера органических анионов (билирубина) составляла 34,5% , что в 1,7 раза выше, чем активность белка, очищенного способом-прототипом.

П р и м е р 2. К 1 мл сыворотки крови верблюда (опыты проводили в Институте биотехнологии АН МНР. г. Улан-Батор) добавляли 120 мкл 50% -ного водного раствора трихлоруксусной кислоты. После тщательного перемешивания смесь оставляли при 1-2^оС на 10 мин для более плотного оформления осадка, который отделяли центрифугированием (5000 g, 1-2^оС, 10 мин). Надосадочную жидкость отбрасывали. В тщательно осушенную центрифужную пробирку добавляли 5 мл охлажденного до -(4,9-7,5)^оС 98% -ного этанола и 1 мкл 11 н. НСl (конечная концентрация НСl 2,0х10^-3 М). Полученный этанольный раствор альбумина подвергали фильтрации через сефадекс LН60 так, как описано в примере 1.

Содержащие белок порции элюата объединяли. Для выделения белка в общий объем этих порция элюата (6 мл) добавляли 30 мг кристаллического ацетата натрия (СН₃СООNа ˙3Н₂О). Смесь оставили при 1-2^о на 30 мин для более компактного оформления высоленного белка, для отделения которого использовали центрифугирование (10000g, 1-2^оС, 10 мин). После удаления надосадочной жидкости белковый осадок лиофилизировали. Лиофилизированный белок растворили в 1 мл дистиллированной воды (рH_1-2o_C 7,4). Дальнейшее выделение нативного альбумина из очищенного препарата белка проводили путем фракционного высаливания альбумина сульфатом аммония, с обессоливанием белка и его лиофилизацией так, как это описано в примере 1. Выход очищенного лиофилизованного белка составил 22 мг (≈ 63% ).

Функциональная активность его в качестве транспортера билирубина, определяемая in vitro, составляла 34,8% , что в 1,6 раза выше активности белка, очищенного способом-прототипом.

П р и м е р 3. К навеске (20 мг) сухого сывороточного альбумина крупного рогатого скота (Rеanal, Венгрия) добавляли 10 мл охлажденного до -(4,9-7,5)^оС 98% -ного этанола и 9 мкл 11 н. НСl (конечная концентрация НСl 11х10^-3 М). Этанольный раствор подвергали гельфильтрации так, как это описано в примере 1. В общий объем содержащих белок порций элюата, добавляли 1 мкл 14 н. NaOH при постоянном энергичном перемешивании. Выпадавший при этом белковый осадок отделяли центрифугированием так, как это описано в примере 2. Выход очищенного лиофилизированного белка составил 14 мг (70% ). Полученный белок лиофилизировали и выделяли из него фракцию нативного альбумина так, как описано в примере 2.

Функциональная активность его в качестве транспортера билирубина, определяемая in vitro, составляла 32,7% , что в 1,7 раза выше активности белка, очищенного способом-прототипом.

Таким образом приведенные примеры конкретного выполнения показывают, что функциональная активность сывороточного альбумина различной видовой принадлежности в качестве транспортера органических анионов (билирубина), очищенного предлагаемым способом, оказывается в 1,6-1,7 раза выше по сравнению с активностью белка, очищенного способом-прототипом. Кроме того, предлагаемый способ очистки альбумина, значительно проще способа-прототипа, так как не требует проведения многократных экстракций с высокотоксичным хлороформом и повторного фракционного высаливания белка, а также позволяет подвергать очистке не только сухие коммерческие препараты альбумина, но и белок, осажденный трихлоруксусной кислотой из сыворотки крови. (56) Авторское свидетельство СССР N 1312947, кл. С 07 К 3/12, 1989.

Использование: изобретение относится к аналитической и препаративной биохимии. Сущность изобретения: исходный препарат или альбумин, осажденный трихлоруксусной кислотой непосредственно из сыворотки крови, растворяют в подкисленном соляной кислотой этаноле и подвергают гельфильтрации с подкисленным этанолом в качестве элюирующего растворителя. Затем из полученного элюата выделяют белок путем ультрафильтрации, высаливания ацетатом натрия или осаждения щелочью. Этот белок лиофилизируют и выделяют фракцию нативного сывороточного альбумина. Положительный эффект: достигается упрощение процесса и сохранение функциональной активности целевого продукта.

1. СПОСОБ ОЧИСТКИ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА, включающий фракционирование, обессоливание, лиофильное высушивание, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и сохранения функциональной активности целевого продукта, исходный альбумин человека растворяют в охлажденном до 4,9 - 7,5^oС 98% -ном этаноле, подкисленном концентрированной соляной кислотой, подвергают гельфильтрации, элюируют подкисленным этанолом и выделяют. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что целевой продукт выделяют ультрафильтрацией или осаждением ацетатом натрия или гидроксидом натрия.