Способ получения аминогрупп в хитозане и его водорастворимых производных Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/46 C08B37/08 

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к определению содержания аминогрупп в хитозане и его производных.

Известен способ определения аминогрупп в хитозане и его производных путем перевода полимера в водный раствор с последующим анализом аминогрупп методом потенциометрического титрования. Недостатком данного способа является высокий предел обнаружения аминогрупп и недостаточная надежность их определения.

Понизить предел обнаружения аминогрупп и обеспечить надежное их определение в хитозане и его производных позволяет способ, основанный на методе Ван-Слайка принятый за прототип. По данному способу водный раствор полимера обрабатывают азотистой кислотой, измеряют объем выделившегося азота и рассчитывают содержание аминогрупп. Недостатком прототипа является высокая сложность и трудоемкость способа.

Целью изобретения является упрощение способа при сохранении низкого предела обнаружения аминогрупп.

Поставленная цель достигается тем, что к раствору добавляют буфер, фермент - хо- линэ1леразу и его субстрат, и регистрируют активность фермента по сравнению с контрольной пробой, не содержащей полимера, а содержание аминогрупп рассчитывают по формуле

V/V, - 1

Я

ь.

ч|

оо

о

гетяА

где А - содержание аминогрупп, мас.%;

V - активность фермента в отсутствие полимера, Е/мг;

Vi - активность фермента в присутствии полимера, Е/мг;

К - коэффициент пропорциональности и m - масса полимера в реакционной смеси, мг.

Пример 1. Перед определением аминогрупп в хитозане и его производных проводят градуировку по хитозану с известным содержанием аминогрупп.

Градуировка метода.

Стандартный образец хитозана из панциря краба анализируют на аминогруппы методами потенциометрического титрования и Ван-Слайка и находят их содержание 8,7 мае. %

Готовят точно 0,2%-ный раствор стандартного хитозана в 0,1 М уксусной кислоте и разводят водой до концентрации полимера 0,025, 0,0175, 0,0125 и 0,005%. Затем отбирают по 1 мл каждого раствора и каждый раз добавляют п реакционную смесь, составленную из 1 мл раствора промышленного препарата бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади (КФ 3.1.1.8) с активностью 1 Е, 1 мл 0,5 М хлорида калия и 1 мл фосфатного буфер (1 /300 М, рН 7,5). Реакцию начинают добавлением 1 мл М бутирилтиохолина при 25°С. В последнюю (контрольную) пробу вместо раствора хитозана вводят 1 мл воды. Рабочие концентрации хитозана в реакционной смеси составляют 0,005. 0,0035, 0,0025, 0,0010 и 0% соответственно. Активность фермента измеряют методом потенциометрического титрования при рН 7,5 и выстраивают гра- дуировочную прямую в координатах V/Vj - молярная концентрация аминогрупп. На графике,приведенном на чертеже, отмечают интервал рабочих концентраций аминогрупп - (0,2 - 1.8) ммоль/мл. Для удобства вычислений выводит расчетную формулу

(У/У - i)-Ctg a Ммн2 п 100

где А - содержание аминогрупп, мас.%;

а- угол наклона прямой, MNHZ молекулярная масса аминогруппы (Ммн2 16);

п - степень разведения раствора полимера (п 5);

m - масса полимера в реакционной смеси, мг.

Объединяют множитель (ctga Ммна Г|х хЮО) в коэффициент пропорциональности К

K ctgaMNH2 -n 100 2J3-10 V(4.15- 1,0) -16 5 ЮО 0,69 и получаем окончательную расчетную формулу

А КV/V, - 1

m

Определение аминогрупп. Анализируют образец хитона, полученный щелочным дезацетилированием панциря краба в течение 40 мин. 200 мг хитозана

растворяют в 100 мл 0,1 М уксусной кислоты, отбирают 1 мг раствора и добавляют к нему 15 мл воды. Получают 0,025%-ный раствор хитозана. Затем проводят ферментную реакцию по прописи, описанной при градуировке метода. Получают значение относительной активности фермента V/Vi - 2,3. Содержание аминогрупп рассчитывают по формуле:

15

А

- 0.69(2.3-1),

0,125

Пример 2. Анализируют образец хитозана, полученный щелочным дезацетилированием панциря криля в течение 6 ч. Определение проводят аналогично примеру 1. V/Vi-2,8, A 9,8%.

Пример 3. Анализируют образец Ыа -соли N-фталилхитозана, полученного из

крабового хитозана и по условиям синтеза, предположительно не содержащего свободных аминогрупп. 200 мг полимера растворяют в 100 мл 0,01 М фосфатного буфера, отбирают 1 мл раствора, добавляют к нему

3 мл воды и получают 0,05%-ный раствор. Далее проводят определение аналогично примеру 1. V/Vi 1,0, А 0%.

Для проверки отсутствия аминогрупп увеличивают испытуемую концентрацию

полимера в 10 раз. Проводят повторное определение аналогично примеру 1. V/V1 1,0, А 0%.

Пример 4. Анализируют образец Na -соли частично замещенного N-фталилхитозана, в котором по условиям синтеза половина аминогрупп.предположительно не замещена. Определение проводят аналогично примеру 3, вводя в измерительную ячейку, 0,025%-ный раствор полимера. V/Vi

2.2, А 3,3%.

Пример 5. Анализируют образец № -соли N-фталилхитозана на остаточные аминогруппы. Растворяют 750 мг полимера в 100 мл 0,01 М фосфатного буфера, отбирают 1 мл раствора и добавляют к нему 9 мл воды. Получают 0,075%-ный раствор, который анализируют в условиях примера 1. V/V, 1,0. А 0%.

Для установления наличия аминогрупп

испытывают исходный раствор полимера с концентрацией 0,75%. Определение проводят аналогично примеру 1. V/Vi 1,5, А 5 .

Пример 6. Перед определением аминогрупп проводят градуировку по стандартному образцу хитозана, использованному в примере 1. Готовят растворы стандартного хитоэана так же, как в примере 1. По 1 мл каждого раствора добавляют в реакционную смесь, составленную из 1 мл промышленного препарата бутирилхолинэ- стеразы сыворотки крови лошади с активностью 1 Е, 1 мл реактива Эллмана (готовят растворением 80 мг 5,5-дитиобис-2-нитро- бензойной кислоты в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера. рН 7,5) и 2 мл 2, М бутирилтиохинолина.В контрольную пробу вместо хитозана добавляют 1 мл воды, Активность фермента определяют по методу Эллмана по количеству тиохинолина с помощью фотоэлектроколориметра при длине волны 412 нм. После этого аналогично примеру 1 строят градуировочную прямую, ко которой находят значение К 0,66, и получают расчетную формулу

А 0,66

V/Vi - 1

m

Анализируют хитозан, полученный щелочным дезацетилированием панциря криля в течение 4 ч 200 мг полимера растворяют в 100 мл 0,1 М уксусной кислоты, отбирают 1 мл раствора и добавляют к нему 19 мл воды. Получают 0,01 %-ный раствор хитозана. Проводят определение активности по методу Эллмана, расчет ведут по формуле (2). V/Vi 2,4, A 9,2%.

Пример 7. В условиях примера 1 анализируют образец 0-метилхитозана (со степенью метилирования 0,5). Исходная концентрация раствора полимера 0,0125%. Получают значения V/Vi 2,5. А 8,3%.

Пример 8. В условиях примера 1 анализируют образец 0-карбоксиметилхи /V

тозана (со степенью карбоксиметилирова- ния 0,8). Исходная концентрация полимера 0,0125%. V/Vi 2,2 и А 6,6%.

Пример 9. В условиях примера 6

анализируют образец частично М-сукцини- лированного хитозана. Исходная концентрация полимера 0,0125%. V/Vi 2,1, А 2,9%.

Реализация предлагаемого способа позволяет упростить и ускорить процедуру анализа (до 3-12 мин). При этом сохраняется низкий предел обнаружения аминогрупп мг, что соответствует их содержанию 5-..

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ получения аминогрупп в хитоза- не и его водорастворимых производных, включающий приготовление водного раствора исследуемого полимера с последующим анализом аминогрупп, о т л и ч а ю- щ и и с я тем, что, с целью упрощения способа при сохранении низкого предела обнаружения аминогрупп, к раствору добавляют буфер, фермент - холинэстеразу и

его субстрат и регистрируют активность фермента по сравнению с контрольной пробой, не содержащей полимера, а содержание аминогрупп рассчитывают по формуле

л - v V/V| 1 ,

где А - содержание аминогрупп, мас.%;

V - активность фермента в отсутствии полимера, Е/мг;

Vi - активность фермента в присутствии полимера, Е/мг;

К - коэффициент пропорциональности и m - масса полимера в реакционной смеси, мг.

Использование: в аналитической химии, при использовании хитозана в медицине и биотехнологии. Сущность изобретения: к раствору исследуемого полимера добавляют буфер, фермент - холинэстеразу и его субстрат, и определяют активность фермента по сравнению с контрольной пробой, не содержащей полимера. Содержание аминогрупп, рассчитывают по формуле А „ V/V| - 1. К Jr, где А m содержание аминогрупп, мас.%; V - активность фермента в отсутствии полимера, Е/мг; Vi - активность фермента в присутствии полимера, Е/мг; К- коэффицпент пропорциональности; m - масса полимера в реакционной смеси, мг, 1 ил.