Способ определения резистентности к вирусу гриппа Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине (к эпидемиологии и иммунологии вирусных инфекций) и может быть использовано для оценки иммунной защиты людей в эпидемии гриппа А и В.

Грипп является глобальной инфекцией, приносящей значительный урон здоровью населения, экономике и обороноспособности страны. Для проведения целенаправленных профилактических мероприятий в открытых (предприятия) и изолированных (воинские гарнизоны, училища, интернаты) коллективах необходима разработка надежного способа контроля защищенности людей в предстоящую эпидемию.

Известен метод основания на количественном определении у людей в реакции непрямой гемагглютинации иммуноглобулинов А в секретах верхних дыхательных путей. Однако названный способ не имеет самостоятельного значения и может быть

использован лишь в совокупности с. исследованием сывороток крови на наличие циркулирующих в крови антител.

Наиболее близким к заявленному (прототип) является широко применяемый способ оценки резистентное,™ к гриппу А и В, предусматривающий количественное выявление у людей в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) циркулирующих в крови специфических антител 1. Поданным авторов, имеется четкая корреляция между заболеваемостью людей в коллективах в эпидемию гриппа и исходными титрами этих антител: лица, имеющие титры 1:20 и меньше (1:20) заболевают гриппом существенно чаще, чем лица с более высокими тит- рами. Однако, при использовании прототипа при обследовании коллективов доля людей с низкими титрами антител (1:20) к возбудителю предстоящей эпидемии составляет подавляющее большинство (903

О

ю о

00

95%). Однако из их числа заболевают гриппом лишь 30-70%, а остальные остаются резистентными, т.е. точность способа довольно низка.

Целью предлагаемого способа является повышение точности определения устойчивости людей к заболеванию гриппом.

Способ осуществляют следующим образом.

В ноябре у лиц, у которых необходимо определить устойчивость к гриппу в предстоящую эпидемию, берут образцы крови из пальца в, количестве 1,0 мл. После осаждения эритроцитарной массы сыворотку отсасывают, разводят ее в пробирках до рабочего разведения 1:10(0,2 мл сыворотки + 1,8 мл физраствора) и прогревают при 56° в течение 1 часа в водяной бане. Далее ставят кинетический вариант РТГА, для чего в лунки серологических макропланшет вносят по 0,1 мл физиологического растпора. Каждую исследуемую сыворотку (разведение 1:10) делят на 6 частей по 0,2 мл каждая и титруют на планшете с разведения 1:10 до 1:320. Таким образом, получают б раститро- ванных образцов одной и той же сыворотки, необходимых для различных временных контактов с антигеном.

Каждую порцию раститрованной сыворотки соединяют (строго фиксируя время) с 0.1 мл 4АЕ антигена актуального вируса гриппа. Из трех ныне циркулирующих серо- подтипом /А(Н11М1), А()и В/ выбирают

антиген из актуального штамма того серо- подтипа, который по ежегодному прогнозу Всесоюзного центра по гриппу и ОРЗ вызовет эпидемию. Соединение сыворотки с 4АЕ

антигена осуществляют по следующей схеме: 1-я порция - в 20 часов, 2-я - в 8 часов утра следующего дня, 3-я - в 10 часов, 4-я - в 11 часов, 5-я - в 11 часов 30 минут и 6-я - в 11 часов 45 минут. В 12 часов во все лунки

планшетов вносят по 0,2 мл 1 % эритроцитов кур. В итоге получается, что 1-я-6-я порции сыворотки конкретного человека контактируют с антигеном соответственно 16,4,2, 1, 0,5 и 0,25 часа.

После оседания эритроцитов фиксируют титры антител в зависимости от времени контакта исследуемой сыворотки с антигеном, что дает возможность наблюдать за скоростью, интенсивностью и прочностью

соединения антител с антигеном (образованием иммунных комплексов) у разных людей. Данные процесса оцениваются в едином интегральном количественном показателе -индексфункциональной гктивности (ФА) антител.

Подсчет индекса ФА осуществляется по двум формулам:

а) для случаев с прочными иммунными комплексами (ПК), т.е. когда титры антител

за 16 часов контакта сыворотки с антигеном не снижаются после достижения максимального показателя, применяется формула:

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки иммунной защиты людей от гриппа А и В в эпидемии. Цель изобретения - повышение точности способа. Способ включает в себя следующие операции: забор сывороток крови в предэпидемический период, определение количества антител в РТГА через 0,25 ч, 0,5 ч, 1,0 ч, 2,0 ч, 4,0 ч и 16,0 ч контакта сыворотки с антигеном, вычисление по формуле индекса функциональной активности антител у обследуемых лиц, выделение группы с высокими (10,0) индексами. Эту группу, считают защищенной от заболевания гриппом. Совпадение прогноза - в 85-90% случаев. Способ обладает простотой и доступностью, его преимущество перед традиционным методом оценки защиты от гриппа по титрам антител заключается в значительно большей точности (точность возрастает по сравнению с прототипом на 75%).

V- - (Tic:To.25) + (TiB:To.5)+ Г16 : Ti) + (Tir,: Т2 ) + (Tis : Т 4 ) + (Tie : Ti6 )

где ,25 обротные величины титров антител после контакта сыворотки с антиге- ном в течение 16,0; 4,0; 2,0; 1,0; 0,5 и 0,25 часа;

tmax время достижения максимального титра антител;

/ ( Tmax : То.25 ) + (Tmax : Тр 5 ) +J ,,... + ( Tmax Tmax )

2(Tmax : TIG )+ Г&ГтТУ +...

где Tmax обратная величина максимального титра антител:50,

V2 - индекс ФА антител.

Далее выделяют группу людей с индексом ФА антител 10 и выше (10) и считают ее защищенной от гриппа о предстоящую эпидемию.55

Примеры конкретного выполнения способа.

П р и м ,е р 1. У Новохатского А.А., 1970 г, рождения, новобранца учебного батальо(1)

Л - индекс ФА антител.

б) для случаев с непрочным ИК, т.е. когда титры антител снижаются после достиже- ния максимального показателя, используется формула:

(2)

на в конце ноября 1988 г. взята кровь из пальца в количестве 1,0 мл. После осаждения эритроцитов отделили сыворотку в количестве 0,6 мл. В начале декабря 1989 г. сыворотку исследовали в РТГА на функциональную активность антител. Для этого 0,2 мл сыворотки соединили в пробирке с 1,8 мл физиологического раствора. С целью удаления термолабильных ингибиторов ге- магглютинации разведенную 1:10 сыворотку прогревали в водяной бане при 56°С в течение 1 часа, Далее в 6 рядов серологического макропланшета, содержащего во всех лунках, кроме первой, по 0,1 мл физраствора, внесли в первые и вторые лунки по 0,1 мл прогретой сыворотки. Все б порций сыворотки раститровали со второй лунки до разведения 1:320. Таким образом, получили б разведений сыворотки с 1:10 и 1:320.

В качестве антигена использовали актуальный ингибиторорезистентный вирус А/Тайвань/1/8б(Н1М1), поскольку прогноз Всесоюзного центра по гриппу и ОРЗ свидетельствовал о возникновении эмидемии гриппа A(H1N1).

Каждую порцию раститрованной сыворотки соединяли последовательно с 0,1 мл 4АЕ антигена по следующей схеме: 1-ая порV , С 320 : 5 ) + ( 320 : 10 ) + ( 320 : 10 ) -Н 320 :320 ) + ( 320 :320 ) + ( 320 ; 320 ) 5 g

За титр антител по прототипному способу принимали показатель, который фиксировали после контакта сыворотки с антигеном в течение 1 часа, т.е. 1:10.

Таким образом, Новохватский А.А. имел перед эпидемией титр антител 1:10 и индекс ФА антител 57,5. Прогноз по прототипному способу - не защищен от гриппа и заболеет, по предлагаемому - защищен и не заболеет.

Вспышка гриппа А(Н1М1) в коллективе развилась в конце января и закончилась в феврале 1989 г. В начале марта 1989 г. у А.А.Новохатского взята вторая сыворотка крови по описанной выше методике, и парные сыворотки (отобранные до и после эпидемии) исследованы в РТГА с вирусом гриппа А/Тайвань/1/86 (H1N1) традиционным способом на предмет обнаружения диагностического прироста антител. Титр антител 1-й сыворотки - 1:10, второй - 1:10. Учитывая, что в период вспышки у А.А.Новохатского не обнаружено клинических проявлений болезни, а также отсутствовала диагностическая сероконверсия антител, сделан вывод о том, что Новохатский гриппом не болел, т.е. был защищен вследствие высокой ФА специфичности антител, несмотря на их низкий количественный показатель.

Пример 2 Приходько И.Г., 1970 г. рождения из того же коллектива. Все манипуляции по забору и исследованию сывороток крови проделаны как в примере 1.

При постановке кинетической РТГА получены следующие данные: контакт сыворотки с антигеном в течение 0,25 часа - титр антител 1:20, контакт 0,5 часа - титр 1:20, контакт 1,0 час -титр 1:20, контакт 2,0 часа-титр 1:20, контакт 4,0 часа-титр 1:20, контакт 16,0 часов - титр 1 10.

ция - в 20 часов, 2-ая - в 8 часов утра следующего дня, 3-я - в 10 часов, 4-я - в 11 часов, 5-я - в 11 часов 30 минут и б-я - в 11 часов 45 минут. В 12 часов в каждую лунку вносили 0,2 мл 1 % эритроцитов кур. После оседания эритроцитов фиксировали титры антител. Были получены следующие показатели в зависимости от времени контакта сыворотки с антигеном: контакт 0,25 часа-титр 1:5, контакт 0,5 часа - титр 1:10, контакт 1,0 часа - титр 1:10, контакт 2,0 часа - титр 1:320гкон- такт 4,0 часа - титр 1:320, контакт 16,0 часов - титр 1:320. Поскольку титр антител не снизился после достижения максимального значения, по формуле 1 рассчитали индекс ФА антител:

0

Поскольку титр антител снизился через 16 часов, для подсчета индекса ФА антител использовали формулу 2:

V25 23 23)+(ЗЭ:2))+(20:2Р)+( 20:2))+(20:23)

2) : П -3.0

Согласно прототипному способу титр антител через 1 час контакта сыворотки с антигеном соответствовал 1:20.

Таким образом, И.Г.Приходько имел перед эпидемией титр специфических антител 1:20 и индекс ФА этих антител 3,0. Прогноз на предстоящую эмидемию по прототипно- ц му и предлагаемому способу - заболеет.

Во время вспышки И.Г.Приходько перенес грипп с клиническими проявлениями болезни. Серологические исследования парных сывороток в РТГА с тем же антигеном подтвердили диагноз: прирост специфических антител с титра 1:20 до 1:160.

Клинические и серологические данные по использованию предлагаемого способа показали, что из 132 исследуемых лиц переболели гриппом 18 (14%), не заболели 114 человек (86%). Совпадение прогноза по предлагаемому способу - 86%, по способу- прототипу - 14%, т.е. точность прогноза по предлагаемому способу была выше, чем по прототипу на 72%. В отдельные эпидемии этот показатель колебался от 72 до 78%. Во всех случаях разница показателей точности прогноза по обоим методам статистически достоверна при ,01 или 0,001.

Таким образом, при использовании предлагаемого способа точность определения устойчивости людей к гриппу возросла на 70-78% по сравнению с прототипным, что свидетельствует о наличии положительного эффекта.

0

0

5

Формула изобретенияцелью повышения точности способа, сыворотку перед выявлением антител инкубируСпособ определения резистентности кют в течение 0.25 ч, 0.5 ч. 1.0 ч, 2,0 ч. 4.0 ч,

вирусу гриппа, включающий забор крови,16,0 ч, вычисляют индекс функциональной

выделение сыворотки, инкубацию ее с виру-5 активности антител, и при его величине

сом гриппа, выявление противогриппозныхбольше или равной 10 определяют резиантител, отличающийся тем. что, сстентность к заболеванию гриппом.