СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНА ГЕПАТИТА С В РЕАКЦИИ АГЛОМЕРАЦИИ ОБЪЕМНОЙ (РАО) Российский патент 2015 года по МПК G01N33/576 A61B10/00 

Способ получения диагностикума для обнаружения антигена гепатита С в реакции агломерации объемной (РАО).

Предлагаемое изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в лабораторной диагностике для прямого обнаружения в крови людей вируса гепатита С.

В настоящее время существует проблема обнаружения вируса гепатита С (ВГС) на ранних стадиях инфицирования человека. Основным широко используемым методом диагностики обнаружения ВГС в сыворотке крови инфицированных больных является полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Однако метод ПЦР, как правило, дает отрицательные результаты первые 6 месяцев после инфицирования ВГС. Кроме того, ПЦР - дорогостоящий метод, требующий зысокой квалификации специалистов, дорогостоящего оборудования, праймеров, реактивов и поэтому он имеет существенные ограничения в использовании для массового скрининга образцов крови.

Известна тест-система в виде набора антигенов для обнаружения антител к вирусу гепатита С человека (см. пат. RU №2262704, МПК G01N 33/576, 20.10.2005 г.), заключающаяся в том, что предлагаемый комплект включает в себя ряд рекомбинантных антигенов, полученных на основе аминокислотных последовательностей наиболее иммунореактивных эпитопов белков вирусов гепатита С разных генотипов, иммобилизованных на поверхности твердофазного носителя.

Недостатком известной тест-системы является сложность ее воспроизведения и длительность исследования, что не дает возможности использовать ее при скрининговых исследованиях.

За прототип выбран способ ускоренной диагностики гепатита С, основанный на обнаружении гемагглютининов вируса гепатита С и антител к ним в РГА и РТГА в крови (см. пат. RU №2194993, МПК G01N 33/569, G01N 33/576, 20.12.2000 г.), предусматривающий обнаружение антигенов ВГС на способности последних агглютинировать эритроциты гусей или голубей в реакции гемагглютинации (РГА), при этом результаты считают положительными, если титры антигенов ВГС в РГА превышают 1:20-1:40.

Недостатки этого способа:

во-первых РГА представляет собой неспецифическую реакцию агглютинации эритроцитов, которая не позволяет утверждать о наличии в крови людей антигенов ВГС, а не других антигенов, обладающих способностью агглютинировать эритроциты гуся (антигены арбовирусов, вируса краснухи и др);

во-вторых для идентификации антигенов ВГС, обнаруженных в РГА, требуется постановка более сложного теста - реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с помощью антител к антигенам ВГС;

в-третьих постановка РТГА может быть затруднена из-за наличия ВГС-специфических комплексов антиген-антитело в сыворотках крови ВГС инфицированных людей.

Таким образом РГА и РТГА для обнаружения антигенов ВГС требует обязательного наличия формалинизированных эритроцитов гуся, способ получения которых из 6-месячного гуся-самца не приводил бы к их способности агглютинировать в присутствии антигена; кроме того, способ не отличается стандартностью и наглядностью результатов в виду того, что рецепторы для гемагглютининов вируса на эритроцитах варьируют от группы крови птицы. Следовательно, этот метод не может получить широкого внедрения в практическое здравоохранение.

Цель предлагаемого изобретения состояла в разработке нового диагностикума, позволяющего осуществлять в короткие сроки скрининговые исследования образцов крови для обнаружения антигена гепатита С в стандартном режиме и отличающегося хорошей наглядностью.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения диагностикума для обнаружения антигена гепатита С в реакции агломерации объемной (РАО), включающем иммунизацию кроликов для получения сыворотки крови с выделением антител к антигенам ВГС и иммобилизацию последних на полимерный носитель с последующим проведением РАО, отличающемся тем, что сыворстку крови получают путем поэтапной иммунизации кроликов штаммом Virus hepatitis С, ГКВ-963 в дозе 5·10⁶ ЛД₅₀, МИЦ (100) в объеме 0,5 мл и выделяют методом Duberta из полученной иммунной сыворотки анти-ВГС, последние ковалентно связывают с полимерными микросферами, для этого 100 мг полимерного носителя дважды отмывают в 0,1 М фосфатно-буферного раствора рН 7,0 и разливают в емкости по 10 мл и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, после деконтируют надосадочную жидкость, а осадок суспендируют в 1,5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора с добавлением 200 мкг/мл анти-ВГС из кроличьей сыворотки, перемешивают, оставляют для контакта в течение 2 ч при температуре 20°C и на 16-18 часов при 7°C, после этого к полученной суспензии добавляют 2 мл 1,0% раствора желатозы на 0,9% растворе хлорида натрия и оставляют при постоянном перемешивании в течение 2 ч при температуре 20°C, затем полученную суспензию диагностикума центрифугируют и трижды отмывают 0,9% раствором хлорида натрия при 3000 об/мин по 5 мин, полученный осадок повторно суспендируют в 8 мл 0,1% раствора желатозы на 0,9% растворе хлорида натрия, после определяют специфическую активность полученного препарата, который затем разливают в ампулы и лиофилизируют.

При этом поэтапную иммунизацию кроликов проводят в четыре этапа, на первом в течение 3-х дней внутривенно в количестве 0,5 мл вводят штамм Д-1, ГКВ-963, на 8, 9 и 10 в полном адьюванте Фрейда в отношении 1:1 и в объеме 0,5 мл вводят подкожно в холку животного, а на 15, 16 и 17 дни повторно вводят тот же препарат в 0,5 мл и на 22 день также в полном адьюванте Фрейда в отношении 1:1 и в количестве 1,0 мл вводят в холку животного и только на 30 день проводят обескровливание животного с последующим выделением из сыворотки анти-ВГС антител.

Кроме того, носитель получают путем растворения в 250 мл дистиллированной воды 1,5 г поливинил пирролидона и 75 мл акролеина, затем к охлажденному до 12°C раствору при перемешивании добавляют раствор 0,3 сафронина в 20 мл 0,1 М натрий хлор, после прекращения подъема температуры охлаждение убирают, реакционную смесь перемешивают 1 час, затем добавляют 2 г персульфата калия и раствор продувают азотом и полимеризацию проводят еще 2 часа при температуре 70°C, после этого полученные микросферы диаметром 1,1 мкм отмывают водой осаждением в центрифуге.

При этом для проведения РАО проводят подготовку исследуемой сыворотки, для этого 0,1 мл последней разводят в 0,9 мл 0,9% раствора хлорида натрия, после этого ее прогревают в течение 30 мин в водяной бане при температуре 56°C и оставляют при 20°C на 10 мин, после этого проводят исследования в РАО.

Способ осуществляется следующим образом.

Для проведения способа необходим исходный материал:

- штамм Virus hepatitis С, Д-1, ГКВ-963, который депонирован и хранится в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН;

Первоначально получают антитела из гепатитной сыворотки. Для

этого проводят иммунизацию кроликов в четыре этапа:

I этап - кроликам в течение 3-х дней внутривенно в объеме 0,5 мл вводят штамм Virus hepatitis С, Д-1, ГКВ-963, в дозе 5·10⁶ ЛД₅₀, МИЦ (100);

II этап - на 8, 9 и 10 дни после первой иммунизации препарат (штамм Д-1, ГВК-963) суспендируют в полном адьюванте Фрейда в отношении 1:1 и в объеме 0,5 мл вводят подкожно в холку животного;

III этап - на 14, 15 и 16 сутки повторяют внутривенное введение препарата в количестве 0,5 мл;

IV этап - на 20 день штамм Д-1 (ГКВ-963) суспендируют в полном адьюванте Фрейда в отношении 1:1 и в 1,0 мл вводят подкожно в холку животного.

Обескровливание животных проводили на 30 день от начала иммунизации.

Антитела вируса гепатита С (ВГС) выделяют из полученной иммунной сыворотки методом Duberta.

Следующий этап в получении диагностикума заключается в иммобилизации анти-ВГС на полимерные носители. В качестве носителя используют сферические полимерные частицы диаметром 1,0 мм, содержащие 1,3 мМ/г альдегидных групп.

Носитель был получен путем полимеризации акролеина в водно-щелочной среде в присутствии радикального инициатора - персульфата калия. Для этого в 250 мл дистиллированной воды растворяют 1,5 г поливинил пирролидона и 75 мл акролеина. К охлажденному до 12°C раствору при перемешивании добавляют раствор 0,3 сафранина в 20 мл 0,1 М NaOH. После прекращения подъема температуры охлаждение убирают, реакционную смесь перемешивают 1 час, затем добавляют к ней 2 г персульфата калия. Раствор продувают азотом и полимеризацию проводят еще 2 часа при температуре 70°C. Микросферы отмывают водой осаждением в центрифуге.

Анти-ВГС ковалентно связывают с полимерными микросферами. Для этого в центрифужный стакан помещают 100 мг носителя (1 мл суспензии микросфер) и дважды отмывают его 0,1 М фосфатным буферным раствором, рН 7,0 разливают в емкости по 10 мл и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. После деконтирования надосадочной жидкости осадок носителя суспендируют в 1,5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора, содержащего 200 мкг/мл анти-ВГС иммуноглобулинов и, перемешивая, оставляют для контакта в течение 2 ч при температуре 20°C. Далее оставляют для контакта при температуре 7°C на 16-18 ч.

После этого к полученной суспензии добавляют 2 мл 1,0% раствора желатозы на 0,9% растворе хлорида натрия и оставляют при постоянном перемешивании в течение 2 ч при температуре (20±2)°C. Полученную таким образом суспензию диагностикума центрифугируют и трижды отмывают 0,9%-ном раствором хлорида натрия при 3000 об/мин по 5 мин. Осадок диагностикума повторно суспендируют в 8 мл 0,1%-го раствора желатозы на 0,9%-ном растворе хлорида натрия.

После этого определяют специфическую активность и специфичность суспензии полученного диагностикума, который затем разливают в ампулы и лиофилизируют.

Применение полученного диагностикума подтверждено примерами 1,2,3 (см. таблицы).

Проведен ряд исследований сывороток крови людей, подозрительных на заболевание гепатитом С в реакции агломерации объемной (РАО) с применением предложенного диагностикума.

Диагностический титр препарата 1:20-1:40.

Для постановки РАО вначале проводят подготовку исследуемых сывороток следующим образом: берут 0,1 мл исследуемой сыворотки и 0,9 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Разведенные сыворотки прогревают в течение (30±1)мин в водяной бане или инактиваторе при температуре (56=1)°C. После этого сыворотки оставляют при (20±2)°C на 10 мин и затем исследуют в РАО.

Затем в U-лунки планшета для иммунологических реакций разливают по 50 мкл 1% раствора нормальной кроличьей сыворотки (НКС). В первую лунку ряда вносят по 50 мкл исследуемой сыворотки и титруют до 12 лунки. В каждую лунку добавляют по 25 мкл суспензии иммобилизированных на микросферах анти-ВГС антител диагностикума, после добавления которого содержимое лунок помешивают покачиванием в течение 1 минуты и оставляют при температуре 20°C на 2,5 часа.

Для контроля диагностикума на спонтанную агломерацию в 2 лунки вносят только НКС и диагностикум. Через 2,5 часа проводят учет реакции.

За положительный результат (+) принимают ярко-розовый агломерат, равномерно выстилающий все дно лунки («зонд»). Положительный результат указывает на наличие в исследуемой сыворотке ВГС. Учет результатов основан на подсчете титров антигена ВГС. Результаты считаются положительными, если титр антигена ВГС в РАО превышает 1:20-1:40. В случае отрицательного результата (-) частицы скатываются на дно в виде плотного осадка «пуговицы» или в виде маленького колечка. При получении отрицательного результата можно предположить, что в исследуемой сыворотке вирус гепатита С не обнаружен.

Пример 1.

Были исследованы 18 сывороток крови людей, подозрительных на заболевание гепатитом С, двумя методами: полимеразной цепной реакцией (ОТ ПЦР) и в серологической реакции РАО с иммуноглобулиновым гепатита С полимерным диагностикумом (см. табл. 1).

Таблица 1 № п/п РАО ПЦР 1 1:160 + 2 1:80 + 3 1:160 + 4 1:40 + 5 1:640 + 6 1:640 + 7 1:40 + 8 1:640 + 9 1:1280 + 10 1:320 + 11 1:320 + 12 1:40 + 13 1:160 + 14 1:1280 + 15 1:640 + 16 1:1280 + 17 1:160 + 18 1:20 +

Из таблицы 1 видно, что все сыворотки по данным ПЦР содержали РНК ВГС и также были положительны в РАО, причем титры антигена ВГС значительно различались, что указывает на возможность дифференциации стадий заболевания гепатитом С.

Пример 2.

Отличается от примера 1 тем, что в качестве исследуемых сывороток взяты сыворотки доноров (см. табл. 2).

Таблица 2 № п/п РАО ПЦР 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 10 0 0

Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что в сыворотках крови исследуемой группы доноров антигены вируса гепатита С не были обнаружены ни методом ОТ ПЦР ни РАО. Это указывает на отсутствие ложноположительных результатов при применении диагностикума иммуноглобулинового полимерного гепатата С.

Пример 3.

Отличается от примера 1 и 2 тем, что в качестве исследуемых сывороток взяты сыворотки больных вирусными инфекциями и контрольные сыворотки больных гепатитом В (из набора для постановки ИФА).

Таблица 3 № п/п сыворотки больных (диагноз) РАО ПЦР 1 грипп 1:80 0 2 грипп 0 0 3 грипп 0 0 4 орви 0 0 5 цмви 0 0 6 герпес 0 0 7 цмви 0 0 8 контрольная вируса гепатита В 0 0 9 контрольная вируса гепатита В 0 0 10 контрольная вируса гепатита В 0 0

Из таблицы З видно, что в одной из сывороток больных гриппозной инфекцией зарегистрированы титры к ВГС и не выявлена РНК ВГС. В данном случае возможны два объяснения наблюдаемого феномена. Во первых: полученный результат ложноположительный и в крови больного присутствуют не анти-ВГС антитела, а имеется повышенный уровень С-реактивного белка, что вызывает спонтанную агглютинацию микросфер диагностикума. Либо обнаруженная концентрация ВГС в крови больного гриппозной инфекцией свидетельствует о ранних сроках заболевания гепатитом С, что дает возможность устанавливать диагноз инфекции в тех случаях, когда методом ПЦР еще не удается обнаружить РНК ВГС.

Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет полученного диагностикума проводить в короткие сроки скрининговые исследования большого количества людей, подозрительных на заболевание гепатитом С в стандартном режиме и хорошей наглядностью без дорогостоящего оборудования, праймеров и реактивов, что значительно сократит себестоимость проведения как единичных, так и массовых исследований.

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Предложен способ получения диагностикума для обнаружения антигена гепатита С в реакции агломерации объемной (РАО). Благодаря повышению специфичности реакции и уменьшению сроков исследования крови изобретение может быть успешно использовано в лабораторной диагностике для прямого обнаружения в крови людей вируса гепатита С. 3 табл., 3 пр.

Способ получения диагностикума для обнаружения антигена гепатита С в реакции агломерации объемной (РАО), включающий следующие стадии:
а) получают сыворотку крови путем иммунизации кроликов вирусным препаратом штамма Virus hepatitis С, Д1, ГКВ-963 в дозе 5·10⁶ ЛД₅₀, МИЦ (100) в четыре этапа:
I - в течение 3-х дней упомянутый препарат вводят внутривенно в объеме 0,5 мл;
II - на 8, 9 и 10 дни после первой иммунизации препарат штамма Virus hepatitis С, Д1 суспендируют в полном адьюванте Фрейда в отношении 1:1 и в объеме 0,5 мл и вводят подкожно в холку животного;
III - на 14, 15 и 16 сутки повторяют внутривенное введение препарата штамма Virus hepatitis С, Д1 в количестве 0,5 мл;
IV этап - на 20 день вирусный препарат штамма Virus hepatitis С, Д1 суспендируют в полном адьюванте Фрейда в отношении 1:1 и в количестве 1,0 мл вводят подкожно в холку животного, затем на 30 день от начала иммунизации проводят обескровливание животных;
б) выделяют из полученной иммунной сыворотки методом Duberta антитела вируса гепатита С (ВГС);
в) готовят предварительно полимерный носитель, который получают путем растворения в 250 мл дистиллированной воды 1,5 г поливинил пирролидона и 75 мл акролеина, затем к охлажденному до 12°С раствору при перемешивании добавляют раствор 0,3 сафронина в 20 мл 0,1 М натрий хлор, после прекращения подъема температуры охлаждение убирают, реакционную смесь перемешивают 1 час, затем добавляют 2 г персульфата калия и раствор продувают азотом и полимеризацию проводят еще 2 часа при температуре 70°С, после этого полученные микросферы диаметром 1,1 мкм отмывают водой осаждением в центрифуге;
г) проводят иммобилизацию на полимерный носитель анти-ВГС гепатита С, которые ковалентно связывают с полимерными микросферами носителя, для этого 100 мг последнего дважды отмывают в 0,1 М фосфатно-буферного раствора рН 7,0 и разливают в емкости по 10 мл и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, после деконтируют надосадочную жидкость, а осадок суспендируют в 1,5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора, с добавлением 200 мкг/мл анти-ВГС из кроличьей сыворотки, перемешивают, оставляют для контакта в течение 2 ч при температуре 20°С;
д) получают суспензию диагностикума, которую центрифугируют и трижды отмывают 0,9% раствором хлорида натрия при 3000 об/мин по 5 мин, полученный осадок повторно суспендируют в 8 мл 0,1% раствора желатозы на 0,9% растворе хлорида натрия, определяют специфическую активность полученного препарата, который затем разливают в ампулы и лиофилизируют;
е) проводят предварительную подготовку исследуемой сыворотки для РАО, для этого берут сыворотку в количестве 0,1 мл, разводят в 0,9 мл 0,9% раствора хлорида натрия, после этого ее прогревают в течение 30 мин в водяной бане при температуре 56°С и оставляют при 20°С на 10 мин, после этого проводят исследования в РАО;
ж) осуществляют реакцию агломерации объемную в планшетах путем внесения в лунки 50 мкл 1% нормальной кроличьей сыворотки, 50 мкл взвеси исследуемой культуры и 25 мкл диагностикума с последующим перемешиванием в течение 1 минуты и контактированием при температуре 20°С в течение 2,5 часов.