Способ подготовки биологической ткани к растровой электронной микроскопии Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 G01N1/28 

Изобретение относится к области биологии и медицины и предназначено для создания равномерной электропроводности ткани перед ее исследованием в растровом электронном микроскопе.

В настоящее время существует несколько способов придания свойств электропроводности биологическим тканям: покрывают их тонким слоем металлов (золотом, платиной, палладием, осмием), напыляют углеродом с последующим нанесением слоя благородного металла. Обрабатывают в растворе четырехокиси осмия с последующей пропиткой иодидами металлов и ацетатом свинца, выдерживают в тиокарбогидразиде или таниновой кислоте, а затем обрабатывают четырехокисью осмия.

Наиболее близким по технической сущности и принятым за прототип является способ придания электропроводности тканям в растворах солей благородных металлов.

Основным недостатком этого способа является длительное время подготовки тканей к исследованию, а также использование драгоценных металлов.

Целью изобретения является сокращение времени подготовки материала и повышение экономичности способа.

Указанная цель достигается тем, что в способе подготовки биологической ткани к растровой электрон ной микроскопии, включающем фиксацию препарата и обработку солями металлов, согласно изобретения, после фиксации проводят обработку солями металлов в растворе, содержащем;

CuSO4 5Н20 - 5-6 мас.%

ZnS04 Н20-7-8 мас.%

25% аммиака - 12-15 мас.%

вода диет. - остальное с последующей обработкой в 2-2,5% растворе Na2S 9Н20.

Способ осуществляется следующим образом.

Ч ч| ГО

2

ю

Образец ткани фиксируют 2-2.5%-ным раствором глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере в течение 2-2,5 ч, отмывают от фиксатора в диет, воде и на 10-15 мин при комнатной температуре погружают в раствор, состоящий из:

CuS04 5Н20-5-6мас.%

ZnS04 -7Н20-7-8 мас.%

25% аммиака - 12-15 мас,%

диет, вода - остальное.

Далее объект переносят на 0,5 - 1 мин в горячую проточную воду (55-60°С). Затем выполняют сульфидирование ткани в 2- 2,5% раствора Na2S 9Н20 при комнатной температуре. Промывку производят 6 проточной воде в течение 0,2-0,5 мин. Далее объект обезвоживают одним из Способов, применяемых в электронной микроскопии и изучают в раствором электронном микроскопе,

При этом смесь препаратов готовят следующим образом.

В дистиллированной воде (60 мл) растворяют сернокислую медь до полного рас- творения, затем сернокислый цинк, добавляют 25% аммиак, доводят объем до 100 мл диет, водой.

П р и м е р 1. Биопсийный материал в виде кусочка ткани печени был зафиксирован в2,5%-ном растворе глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере в течение 2 ч, тщательно промыт в дистиллированной воде. Затем на 15 мин при комнатной температуре был погружен в раствор, состоящий из, мас.%:

CU-S04 5Н20-5

ZnSCM 7Н20 - 7

25% аммиак - 12

диет, вода - остальное.

Далее препарат был перенесен на 1 мин в горячую (60°С) проточную воду. Затем выполняли сульфидирование ткани в 2,5%- ном растворе Na2S 9НаО при комнатной температуре в течение 1 мин. Промывают 0,5 мин в проточной воде. После этого подготовленный таким образом материал обезвоживали в спиртах восходящей концентрации от 30° до 100°, наклеивали обьект на подложку и изучали в растровом электронном микроскопе.

Было отмечено, что данная обработка не повлияла на качество изображения исследуемого материала и на получаемую при этом информацию. Качество иллюстраций, полученных предлагаемым способом, не уступает результатам при использовании способа прототипа.

П р и м е р 2. Участок подколенной вены фиксировали в течение 2 ч в 2,5%-ном растворе глутарового альдегида, промывали в диет. воде. Погружали на 10 мин при комнатной температуре в раствор, состоящий из, мас.%:

CuSCM -5H20 -6 ZnS04 7Н20 - 8 25% аммиак - 15

диет, вода - остальное.

Затем препарат перенесли на 1 мин в горячую воду. Сульфидирование выполняли в 2 %-ном растворе NaaS 9Н20 в течение 1 мин при комнатной температуре. Промыли

0,5 мин в проточной воде. Далее подготовленный материал обезвоживали в спиртах восходящей концентрации от 30° до 100°, наклеивали на подложку и изучали в растровом микроскопе.

Поверхность эндотелия, участка подколенной вены, обработанной данным способом, имеет оптимальный контраст, внутрисосудистые образования, нити фибрина. Для сравнения с прототипом была исследована поверхность биопсийного материала органов пищеварения, сосудов и камней желчного пузыря у 72 больных по предлагаемому способу и способу прототипу.

Исследования проводили при различных увеличениях микроскопа IEM - 100 S с растровой приставкой АЗИД-5(Япония)(см. таблицу).

При этом отмечено, что качество иллюстраций, полученных предлагаемым способом, не уступает результатам при использовании способа-прототипа. Кроме того, кристаллические образования выглядят более контрастнее и отчетливее, а время

подготовки образцов к исследованию сокращается в 2 раза (без учета времени фиксации).

Формула изобретения Способ подготовки биологической ткани к растровой электронной микроскопии путем ее фиксации с последующей обработкой солями металлов, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени под- готовки и повышения экономичности способа, обработку ткани проводят в течение 10-15 мин смесью, содержащей следующие компоненты, мае. CuSOi 5Н2О - 5-6; ZnSCM 7Н20 - 7-8; 25%-ный аммиак - 12-15 и дистиллированная вода - остальное, а затем в течение 0,5-1 мин 2-2,5%- ным раствором NaaS ЭНаО.

Зависимость качества изображения в растровом электронном микроскопе от концентрации используемых растворов

Использование: в области биологии и медицины и предназначено для создания равномерной электропроводности ткани перед ее исследованием в растровом электронном микроскопе. Сущность изобретения: биологическую ткань фиксируют и затем обрабатывают в течение 10-15 мин смесью, содержащей следующие компоненты, мас.%: CuS04 5Н2О 5-6; 7Н2О 7-8; 25% аммиака 12-15; диет, вода - остальное, а затем в 2-2,5% растворе Na2S ЭНзО на дистиллированной воде в течение 0,5-1 мин. При этом время подготовки образцов сокращается в 2 раза и полностью исключается применение драгоценных металлов.