Способ выделения грибов рода РаесILомYсеS из патологического материала больных Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к микологии, инфекционным болезням, гематологии, пульмонологии, гастроэнтерологии, аллергологии, и может быть использовано при постановке диагноза пециломикоза, сепсиса, септицемии, анемии, пневмонии, кожного или респираторного аллергоза.

До настоящего времени выделение грибов рода Paecilomyces от больного человека относилось к казаустическим случаям и по данным литературных источников не превышало 1 - 1,5%, что затрудняло диагностику заболевания, вызванного грибами этого рода.

В 1982 году З.А.Гмясов и соавторы предложили диагностику пециломикоза по способу выявления сержантеллоподобных

образований (СПО), которые по их мнению являются оболочками гриба. Свое заключение они обосновали тем, что СПО были обнаружены в мазках периферической крови больных, от которых был выделен гриб P.varlotii, а также в мазках периферической крови животных, зараженных этим же видом гриба. Такое обоснование постановки диагноза пециломикоза по выявлению СПО в мазках периферической крови было подвержено критике, так как специфического отличия оболочки гриба от, например, оболочки эритроцита авторы не предложили

Известен способ культурального исследования, когда кровь собирают в растворы цитратной или оксалатной солей, затем распределяют ее по поверхности агаровых сред в чашках Петри или посевы небольших

XI

3 g

VI

ы

комочков патологического материала, производят на поверхности среды нанесением минимальных комочков исследуемого материала в нескольких точках на расстоянии 1 - 2 см один от другого. Выращивание производят при 25° и 37°С раздельно. Рост грибов появляется на 3 - 5 день, но посевы рекомендуют выдерживать в термостате до 30 дней для окончательного суждения об отсутствии роста грибов.

Непригодность вышеуказанных способов для культурального выделения грибов рода Paecilomyces из патологического материала заключается в том, что тканевая паразитическая форма грибов P.varlotli и P.virldis обладает особым пропизмом к внутриклеточному паразитированию и нуждается, по нашему мнению, в особых условиях культивирования. Быстрое изменение из среды обитания при посевах на обычные агаровые среды (Сабура сусло-агар и др.), приводит их к гибели и отрицательным результатам обследования.

Целью предполагаемого изобретения является повышение чувствительности метода.

Способ выделения грибов рода Paecilomyces из патологического материала больных путем его инкубации на агаровой среде при температуре 25°С и микроскопического исследования для идентификации колоний грибов, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, исследуемый материал предварительно выдерживают в гепаринизированной среде 199 в течение 18 - 24 ч при температуре 25°С.

Новым в предложенном техническом решении предварительная инкубация материала в гепаринизированной среде 199.

Способ осуществляют в 2 этапа,

1-й этап исследований.

После предварительной обработки спиртом мякоти безымянного пальца делают укол индивидуальным стерильным копьем по упора. У каждого пациента кровь берут стерильным капилляром от аппарата Панченкова, откуда затем в равных частях переливают в две стерильные пробирки, содержащие по 5,0 мл гепаринизированной среды 199. Забор мокроты, грудного молока, кала, мочи осуществляется в количестве 1,0 мл стерильные чашки Петри. Взятие образцов патологического материала от больного осуществляют непосредственно в момент исследования.

Из 1-й пробирки не позднее 15-20 мин от момента забора патологического материала стерильной пипеткой производят забор крови (грудного молока, мокроты, мочи или

кала) в виде 1 капли, которая наносится на стерильное предметное стекло и покрывается стерильным покровным стеклышком. Изучение образцов производят в световом микроскопе при х80 и х400. Целью исследования является нахождение тканевой паразитической формы грибов P.variotii и P.virfdls в виде эндоспор, молодой (промежуточная форма) и зрелой сферул. Эндоспора-круглок или яйцевидной формы образование, имеющее слабовыраженную светлую 2-х контурную оболочку и зеленый с флюоресцирующим оттенком центр размерами 0,4 - 1,0 х 0,4 х 1.5 мкм.

Молодая сферула (промежуточная форма) - почти круглое или овальное образование с 2-х контурной оболочкой зеленого цвета с флюоресцирующим оттенком и светло-зеленым центром, размерами 4,4 х 7,0 х

x6.0- 11,2 мкм.

Зрелая сферула - округлое или овальное образование с истонченной 2-х контурной оболочкой, внутри которой определяются шаровидные образования эндоспоры. Размеры зрелых сферул были 7,8-27,0x8,6-28 мкм.

В препарате также встречаются бесформенные образования - оболочки опустевших сферул. Обычно внутри их или на

них обнаруживаются от одной до нескольких эндоспор.

После осмотра стекла сохраняют на столе при комнатной температуре. Последующее их изучение осуществляется через 1,5 и

18 ч с целью выявления прорастания мицелия из вышеуказанных тканевых форм. Исследования на данном этапе позволяют дифференцировать пециломикоз от сепсиса или инфекции другой этиологии, что позволяет в течение первых же часов наблюдения больного приступить к этиопатогенетиче- скому лечению.

2-й этап исследований.

Содержание 2-й пробирки после 18 24-часовой инкубации в гепаринизированной среде 199 при комнатной температуре по 1,5 мл тонким слоем разливают по поверхности агаровых сред (1-3 чашки Петри) и далее сохраняют при комнатной температуре. Рост колоний обычно происходит на 4 день от момента посева.

Обследование проведено у 104 больных с клиническим диагнозом пециломикоз, в возрасте от 11 мес. до 67 лет. Как показали проведенные нами исследования с использованием вышеизложенного способа диагностики (табл.2), выделение грибов P.variotii и P.viridls было достигнуто от 24% от 73% (в среднем 44%), тогда как по имеющимся в

мировой литературе сведениям случаи выделения грибов рода Paecilomyces от больных не превышали 1 - 1.5%.

П р и м е р 1. Б-я Ш, 40 лет. После обработки кожи мякоти безымянного пальца спиртом сделан прокол кожи, после чего произведен забор крови в стерильный индивидуальный капилляр аппарата Панчен- кова и в равных частях внесли в 2 стерильные пробирки, содержащие по 5,0 мл стерильной гепаринизированной среды 199. Через 1,5 мин из осадка 1-й пробирки произведен забор 1-й капли крови, которую нанесли на стерильное предметное стекло и покрыли стерильным покровным стеклышком. При изучении капли в световом микроскопе в каждом поле зрения среди клеток крови обнаружены сферулы гриба, находящиеся на различных стадиях развития. Через 18 ч в капле на стекле, сохраняющейся при комнатной температуре, обнаружено прорастание сферул в мицелий.

Таким образом на 1-м этапе обследования больного в крови было обнаружено присутствие в ней сферул грибов рода

После суточной инкубации 2-й пробирки при комнатной температуре гепаринизи- рованная среда с кровью была разлита по 1,5 мл по поверхности агаровой среды (сусло-агар) 3 чашек Петри и поставлены в термостат при температуре 25°С. На 4-й день инкубации в чашках Петри обнаружен рост от 1 до 4 колоний, которые были индентифи- цированы как гриб P.variotil.

Анамнестически установлено, что у больной в течении 6 лет после перенесенного гриппоподобного состояния (озноб, боль в .носоглотке, головная и мышечная боли, слабость, недомогание, потливость) спустя неделю появилась одышка, усиливающаяся при физической нагрузке, периодическая заложенность носовых ходов и приступы удушья. Развитие последних наблюдалось при контактах с почвенной пылью и в ночное время. Заболевание протекало круглогодично с циклическими обострениями 1 - 2 раза в год в весеннее и (или) осеннее время. Кроме вышеуказанных симптомов у нее периодически появлялись высыпания уртикарий, сопровождаемых зудом кожи, а также постоянно отмечались слабость, недомогание, потливость.

Клинически у больной установлена хроническая аллергическая интерстициальная пневмония, бронхиальная астма, ринит, крапивница.

В гемограмме больной: Нв- 160 г/л, эр. - 5,3-10 12/л, Цп - 0,9,Л - ты 4-10%, п -

-35, э-20,6- 1, л- 29, м-9, СОЭ -8 мм/ч.

Анализ мочи без изменений. С использованием радиоаллергосорбентного теста и иммуноферментного анализа в сыворотке крови больной обнаружены аллергенспе- цифические IgE - и Ig G антитела к аллергену гриба Paecilomyces.

На обзорной рентгенограмме больной

на фоне повышенной прозрачности легочной ткани с обеих сторон в средах и нижних отделах легких мелкосетчатая деформация легочного рисунка с наличием мелкоочаговых теней, располагающихся преимущественно по ходу сосудов. Корни легких расширены и деформированы, стенки бронхов уплотнены. В корнях увеличенные брон- хопульмональные лимфатические узлы. На ЭКГ: Синусовая брадикардия. Выраженные метаболические изменения в миокарде желудочков.

Функция внешнего дыхания: Изменение дыхательной функции по обструктивно- рестриктивному типу.

Клинический диагноз: Инфекционно-аллергический бронхолегочный пециломикоз. Хроническая рецидивирующая форма средне-тяжелого течения.

Использование предлагаемого способа

выделения грибов рода Paecilomyces, позволило установить диагноз и провести эти- опатогенетическое лечение с хорошим терапевтическим эффектом. П р м м е р 2. Б-й У.. 42 лет.

Образцы мокроты были взяты непосредственно в 2 чашки Петри со стерильной гепаринизированной средой 199. Через 15 мин из 1-й чашки был произведен забор материала, 1 капля которого была нанесена

на предметное стекло, и покрыта стерильным покровным стеклышком. При изучении капли мокроты в световом микроскопе обнаружено множество сфекуя на разных стадиях развития (энедоспоры, молодые и

зрелые сферулы). Через 1,5 ч в капле, сохранявшейся при комнатной температуре обнаружено прорастание мицелия из зрелых сферул, который наиболее был выражен через 18 ч,

После суточной инкубации мокроты в

гепаринизированной среде 199 при комнатной температуре был осуществлен посев мокроты на агаровую среду Сабуро в 3 чашках Петри. Чашки с посевами поставлены в

термостат с температурой 25°С. На 4-й день с момента посева на 3-х чашках обнаружен рост от 1 до 8 колоний, которые были инден- тифицированы как колонии гриба P.virldis. Анамнестически установлено, что в течение 10 лет у больного- ранней весной

и/или осенью после гриппоподобного состояния кратковременное повышение температуры тела до 38°С спустя озноб, головные и мышечные боли, заложенность ходов с обычными водянистыми выделениями, 7 - 10 дней возникает одышка со свистящим дыханием, приступы удушья, периодическая заложенность носовых ходов, которые сочетаются со слабостью, недомоганием,головокружением, повышенной потливостью. Данное состояние сохраняется в течение 1-1,5 мес. и исчезали. Установлена хроническая и аллергическая интерстициальная пневмония, бронхиальная астма, ринит, аллергический миокардит, анемия.

В гемограмме больного: Нв - 100 г/л, лейкоциты - 7,2-10 9/л, п - 7, с - 48, э - 10, б - 3, л - 22, М - 10, СОЭ 30 мм/ч. Анализ мочи был без патологии.

С использованием радиоаллергосор- бентного теста и иммуноферментного анализа в сыворотке больного обнаружены аллергенспецифические IgE - и Ig G - антитела к грибу Paecilomyces.

На рентгенограмме больного с обеих сторон, больше справа, в нижне-легочном поле на фоне усиленного с пятнисто-сетчатой деформацией легочного рисунка наблюдались рассеянные мелкоочаговые тени с нечеткими контурами. Рисунок корней расширен, деформирован. В корнях увеличенные лимфатические узлы.

На ЭКПсинусовая аритмия, признаки нарушения внутрижелудочковой проводи-мости, диффузные изменения в миокарде желудочка.

Функция внешнего дыхания: нарушение дыхательной функции по обструктивно- му и рестриктивному типам.

Клинический диагноз: Инфекционно-ал- лергический бронхолегочный пециломикоз. Хроническая рецидивирующая форма средне-тяжелого течения. Аллергический миокардит. Анемия.

Клиническая картина заболевания, проявляющаяся первоначально а виде гриппоподобного состояния, спустя 7-10 дней от начала которого появляются клинические симптомы аллергии, наличие в сыворотке аллергенспецифическихIgE - иIg G - антител к грибу Paecilomyces, а также культуральное выделение из мокроты гриба Р. viridls позволили установить диагноз и провести этиопатогенетическое лечение с хорошим терапевтическим эффектом.

Положительный эффект предлагаемого

метода выделения грибов рода Paecilomyces от больных заключается в том, что путем помещения патологического материала (кровь, грудное молоко, мокрота,

моча, кал) в гепаринизированную среду 199 достигается сохранение жизнеспособности сферул грибов P. varlotil и P.vlridis. Дальнейший перевод их среды обитания с температурного режима организма хозяина

(37°С) на температурный режим комнаты (25°С) позволяет большинству из них начинать прорастание в мицелий в благоприятных условиях.

При сравнении результатов, полученных нами с использованием предлагаемого способа, с данными других авторов (табл,1) видно преимущество первого.

Он прост в исполнении. Позволяет в течение суток определять наличие грибковой

инфекции и затем, спустя несколько дней, дифференцировать ее.

Сравнительные данные выделения грибов рода Paecilomyces от больных по известному и предлагаемому способам

представлены в табл. 1.

Применение предлагаемого способа оказывает существенное влияние на выбор характера терапии и своевременность ее начала.

Способ показывает высокое совпадение с результатами клинического и иммунологического диагноза (табл.2).

Сводные данные выделения грибов рода Paecilomyces от больных с клиническим диагнозом пециломикоз представлены в табл, 2.

Формула изобретения Способ выделения грибов рода Paecilomyces из патологического материала

больных путем его инкубации на агаровой среде при 25°С и микроскопического исследования для идентификации колоний грибов, отличающийся тем, что, с целью, повышения чувствительности способа, исследуемый материал предварительно выдерживают в гепаринизированной среде 199 в течение 18-24 ч при 25°С.

Таблица

Способ выделения грибов рода Paecilomyces из патологического материала больных. Использование: в области медицины, в частности в микологии, гематологии, пульмонологии, гастроэнтерологии, аллергологии, и может приняться при постановке диагноза пециломикоза, сепсиса, септицемии, анемии, пневмонии, кожного или респираторного аллергоза. Сущность изобретения: производят забор крови или грудного молока, или мокроты, или кала больного, которые помещают в гепаринизи- рованную среду 199 (Хенкса, Игла) (4,5 мл среды и 0.5 мл раствора гепарина) и выдерживают при комнатной температуре (25°С) в течение 18 - 24 ч с последующим распределением ее по поверхности агаровых сред. Рост колоний грибов рода Paecilomyces обнаруживается с 4 дня от посева, по которым, после их идентификации, ставят диагноз пе- циломикоз Способ позволяегповысить чувствительность до 44 - 73%. 2 табл сл С

Таблица2