Способ первичного посева биоматериала, выделенного из нижних дыхательных путей пациентов с муковисцидозом Российский патент 2018 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12R1/01 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для первичного посева биоматериала, выделенного из дыхательных путей пациентов с муковисцидозом при проведении микробиологического исследования.

Уровень техники

Известны способы первичного посева биоматериала, выделенного из дыхательных путей пациентов с муковисцидозом с использованием различных комбинаций наборов питательных сред: Мак-Конки, маннитолового солевого агара, селективной среды для Burkholderia cepacia, шоколадного агара, дезоксирибонуклеазной среды; с использованием агара Сабуро, маннитолового солевого агара, селективной среды для Burkholderia cepacia, шоколадного агара, среды Левенштейна-Йенсена; с использованием кровяного агара, шоколадного агара, агара Эндо, желточно-солевого агара, агара Сабуро, цетримидного агара и селективной среды BCSA для Burkholderia cepacia.

Известен способ первичного посева биоматериала, выделенного с дыхательных путей пациентов с муковисцидозом с использованием 5 питательных сред: агара Мак-Конки, маннитолового солевого агара, селективной среды для Burkholderia cepacia, шоколадного агара, дезоксирибонуклеазной среды. Суть метода заключается в первичном посеве биоматериала на чашки Петри с вышеуказанными средами с последующей инкубацией при 35-37°С.[Lisa Saiman, Jane Seigel. Infection Control Recommendations for Patients With Cystic Fibrosis: Microbiology, Control Practices to Prevent Patien-to-Patient Transmission. The Official Journal of the Society for Healthcare Epidemiology of America. May 2003, Vol. 24, №5].

Недостатками данного способа являются отсутствие в предлагаемой схеме питательных сред для культивирования грибов, что ограничивает возможности их выделения из биоматериала.

Известен способ первичного посева биоматериала, выделенного из дыхательных путей пациентов с муковисцидозом с использованием 5 питательных сред: агара Сабуро, маннитолового солевого агара, селективной среды для Burkholderia cepacia, шоколадного агара, среды Левенштейна-Йенсена. Суть метода заключается в первичном посеве биоматериала на чашки Петри с вышеуказанными средами с последующей инкубацией при 28-37°С [Laboratory Standarts for Processing Microbiological Samples from People with cystic fibrosis. First edition. September 2010].

Недостатками указанного способа является отсутствие питательных сред для первичного выделения энтеробактерий и ряда других грамотрицательных палочек, а также гемолизирующих стрептококков.

За прототип принимается способ первичного посева биоматериала с использованием кровяного агара, шоколадного агара, агара Эндо, желточно-солевого агара, агара Сабуро, цетримидного агара и селективной среды BCSA для Burkholderia cepacia. Суть способа заключается в первичном посеве биоматериала на чашки Петри с вышеуказанными средами с последующей инкубацией при 28-37°С. [Национальный консенсус «Муковисцидоз: определение, диагностические критерии, терапия», Москва, 2016 год].

Недостатками данного метода является использование набора из 7 питательных сред, что экономически является более затратным, чем при использовании других алгоритмов исследования. При этом часть сред являются дублирующими друг друга по ростовым свойствам искомых микроорганизмов.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является улучшение диагностики инфекционных осложнений у пациентов с муковисцидозом путем получения в первичном посеве отделяемого из дыхательных путей от пациентов с муковисцидозом максимального количества клинически значимых микроорганизмов с использованием минимального количества питательных сред. Технический результат изобретения заключается в том, что заявленный способ посева с использованием предлагаемого набора питательных сред позволяет одномоментно выделить при первичном посеве микроорганизмы, имеющие клиническое значение при муковисцидозе: бактерии рода Pseudomonas, Burkholderia, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Achromobacter, Chryseobacterium, Brevundimonas, Inquilinus, Kingella, Staphylococcus, Mycobacterium, а также энтеробактерии и грибы.

Это достигается тем, что в отличие от известных способов первичного посева биоматериала, выделенного с дыхательных путей пациентов с муковисцидозом используется набор из 5 питательных сред, включающий в себя 5% кровяной агар с дефибринированной бараньей кровью [Atlas, Ronald М., 1946-. Handbook of microbiological media. - Taylor & Francis, 2010-01-01.], шоколадный агар, универсальную хромогенную среду [1. Pezzlo М (1998), Clinical Microbiology Reviews 1:268-280; 2.Wilkie M.E., Almond M.K., Marsh F.P. (1992), British Medical Journal 305:1137-1141; 3. Friedman M.P. et al (1991), Journal of Clinical Microbiology, 29:2385-2389; 4. Murray P., Traynor P. Hopson D., (1992), Journal of Clinical Microbiology 30:1600-1601; 5. Soriano F., Ponte C., (1992), Journal of Clinical Microbiology 30:3033-3034; 6. Merlino et al (1995) Abstr. Austr. Microbiol. 16(4):17-3.], селективную среду для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) содержащую бацитрацин и полимиксина сульфат [Регистрационное удостоверение на медицинское изделие ФСЗ 2012/12473], а также агар Сабуро с хлорамфениколом.

Осуществление изобретения

Сущность предложенного метода заключается в следующем: на поверхность чашек с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью, шоколадным агаром, универсальной хромогенной средой, селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-arap) с бацитрацином и полимиксина сульфатом производится посев гомогенизированного материала из нижних дыхательных путей пациентов с муковисцидозом с использованием техники посева «штрихом». Затем засеянные чашки с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью, универсальной хромогенной средой инкубируются в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 часов с ежедневным просмотром посевов. Чашки с шоколадным агаром инкубируются при 35°С в атмосфере 5-7% CO₂ в течение 24-48 часов с ежедневным просмотром посевов. Засеянные чашки с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-arap) с бацитрацином и полимиксина сульфатом инкубируются 24-48 часов при температуре 37°С, далее инкубируются до 14 суток при температуре 28°С с ежедневным просмотром посевов. На поверхность чашек с агаром Сабуро с хлорамфениколом производится посев гомогенизированного материала методом бляшек с последующей инкубацией при 28°С до 14 суток с ежедневными просмотрами посевов.

Предлагаемый способ позволяет получать точные качественные и количественные характеристики состояния микробиоценоза дыхательных путей пациентов с муковисцидозом для улучшения диагностики инфекционных осложнений у данной группы пациентов.

Это может быть необходимо для проведения регулярного микробиологического мониторинга пациентов с муковисцидозом, а также для статистических исследований в рамках ведения ежегодного единого Регистра больных муковисцидозом в Российской Федерации [проект Регистр больных муковисцидозом Российской Федерации одобрен Комитетов по Этике ФГБНУ «МГНЦ» 20 декабря 2012 года].

В предложенном способе первичного посева биоматериала, выделенного с дыхательных путей пациентов с муковисцидозом предусмотрены следующие отличия: использование селективной среды для культивирования Burkholderia cepacia (OFPBL-arap) с бацитрацином и полимиксина сульфатом позволяет выделять из первичного материала не только указанного возбудителя, но также и представителей родов Achromobacter spp., Chryseobacterium spp., Brevundimonas spp., Inquilinus spp., Kingella spp.и некоторых других редко встречающихся представителей неферментирующих грамотрицательных бактерий, а использование продленного срока инкубации посевов позволяет использовать ее для выявления нетуберкулезных; микобактерий (в частности, Mycobacterium abscessus); применение универсальной хромогенной среды позволяет выявлять и дифференцировать ряд энтеробактерий, Staphylococcus aureus, а также бактерии рода Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas в первичном посеве, что позволит отказаться от использования дополнительного перечня питательных сред.

Осуществление предлагаемого способа можно продемонстрировать на следующих примерах:

Пример 1.

Пациент С., 7 лет. Диагноз: муковисцидоз, смешанная форма, тяжелое течение. В лабораторию поступил биоматериал мокрота. Произведен первичный посев двумя способами: способом, описанном в прототипе, а также предлагаемым нами способом с последующей инкубацией при 28-37°С.

Были получены следующие результаты:

Таким образом, благодаря применению предлагаемого нами способа был получен рост 4 микроорганизмов на 4 питательных средах, в то время как при использовании способа, описанного в прототипе, был получен рост 3 культур микроорганизмов на 5 питательных средах при первичном посеве. При использовании предлагаемого нами способа посева был получен рост культуры Pseudomonas aeruginosa 10⁶ на чашках с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью, шоколадным агаром и универсальной хромогенной средой (3 чашки). В то же время, при использовании способа посева, описанного в прототипе, был получен рост культуры Pseudomonas aeruginosa 10⁶ на чашках с кровяным агаром, шоколадным агаром и средой Эндо и цетримидном агаре (4 чашки).

При использовании предлагаемого нами способа посева был также получен рост культуры Kingella denitrificans 10⁴, рост которой не мог быть получен на селективной среде BCSA для Burkholderia cepacia ввиду ее узкоспецифичности. Тем самым, несмотря на то, что при использовании способа, описанного в прототипе, применяется 7 питательных сред, это не приводит к увеличению выделения количества микрорганизмов в первичном посеве. Кроме того, рост большинства возбудителей отмечается не только на основных средах (таких, как кровяной агар), но и дублируется на элективных средах (цетримидный агар).

Таким образом, использование предлагаемого нами способа позволяет получать более широкий диапазон возбудителей при первичном посеве с использованием меньшего количества питательных сред.

Пример 2.

Пациент А., 13 лет. Диагноз: муковисцидоз, смешанная форма, тяжелое течение. В лабораторию поступил биоматериал мокрота. Произведен первичный посев двумя способами: способом, описанном в прототипе, а также предлагаемым нами способом с последующей инкубацией при 28-37°С.

Были получены следующие результаты:

Таким образом, благодаря применению предлагаемого нами способа первичного посева было выделено 5 видов микроорганизмов, в то время как при использовании способа, описанного в прототипе, в первичном посеве получено 3 вида микроорганизмов. Благодаря использованию универсальной хромогенной среды был получен рост 2 культур энтеробактерий (Enterobacter aerogenes 10⁶, Citrobacter freundii 10⁵), которые нельзя было различить при использовании других сред ввиду морфологической идентичности колоний. Благодаря использованию селективной среды для Burkholderia cepacia (OFPBL-arap) с бацитрацином и полимиксин сульфатом был получен рост не только культуры Burkholderia cepacia 10⁴, но и культуры Chryseobacterium indologenes 10³, рост которой не мог быть получен на селективной среде BCSA для Burkholderia cepacia ввиду ее узкоспецифичности. Кроме того, благодаря продленной схеме инкубации - 14 суток - был получен рост такого значимого возбудителя, как Mycobacterium abscesus 10⁴ (на 14 сутки инкубирования).

Таким образом, использование предлагаемого нами способа позволяет получать более широкий диапазон возбудителей при первичном посеве и минимизировать риск некорректной идентификации морфологически сходных культур энтеробактерий.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для первичного посева биоматериала, выделенного из нижних дыхательных путей пациентов с муковисцидозом, при проведении микробиологического исследования. Способ предусматривает посев на поверхность чашек с 5% кровяным агаром, шоколадным агаром, универсальной хромогенной средой, селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) гомогенизированного материала из нижних дыхательных путей пациентов с муковисцидозом с использованием техники посева «штрихом» с последующим инкубированием при заданных параметрах процесса с ежедневным просмотром посевов. На поверхность чашек с агаром Сабуро производится посев гомогенизированного материала методом бляшек с последующей инкубацией при 28°C до 14 суток с ежедневными просмотрами посевов. Изобретение позволяет улучшить диагностику инфекционных осложнений у пациентов с муковисцидозом. 2 табл., 2 пр.

Способ первичного посева биоматериала, выделенного из нижних дыхательных путей пациентов с муковисцидозом, отличающийся тем, что на поверхность чашек с 5% кровяным агаром, шоколадным агаром, универсальной хромогенной средой, селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) производят посев гомогенизированного материала с нижних дыхательных путей пациентов с муковисцидозом с использованием техники посева «штрихом»; затем засеянные чашки с 5% кровяным агаром, универсальной хромогенной средой инкубируют в термостате при температуре 37°C в течение 24-48 часов с ежедневным просмотром посевов; чашки с шоколадным агаром инкубируют при 35°C в атмосфере 5-7% CO₂ в течение 24-48 часов с ежедневным просмотром посевов; засеянные чашки с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) инкубируют 24-48 часов при температуре 37°C, далее инкубируют до 14 суток при температуре 28°C с ежедневным просмотром посевов; на поверхность чашек с агаром Сабуро производят посев гомогенизированного материала методом бляшек с последующей инкубацией при 28°C до 14 суток с ежедневными просмотрами посевов.